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  • 多肽固相合成法

    多肽固相合成法——英文解释: solid phase peptide synthesis 简写为SPPS。在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield,他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。由于R.BruceMerrifield在肽合成方面的贡献,1984年获得了诺贝尔奖。

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    (图)多肽固相合成法多肽固相合成法

    1963年,R.B.Merrifield创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上,然后在此树脂上依次缩合氨基酸,延长肽链、合成蛋白质的固相合成法,在固相法中,每步反应后只需简单地洗涤树脂,便可达到纯化目的。克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难,为自动化合成肽奠定了基础。为此,Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖。固相法得到了很大发展,除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外,又发展了Fmoc固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基)。以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展,并仍在不断得到改造和完善。

    实验方法/多肽固相合成法 编辑

    (图)多肽固相合成法多肽固相合成法

    本实验中由苯胺醋酸经高温脱水而生成酰胺,由于反应温度高,会引起反应原料苯胺的氧化,所以此反应中加入还原剂金属锌以抑制苯胺的高温氧化。

    本实验中产品是经水结晶而纯化的,结晶是最简单、有效、经济的纯化手段,结晶时常有少量絮状物不溶,导致加入过多溶剂形成不饱和溶液,使结晶收率低或不结晶。为此结晶溶液需过滤除去絮状不溶物杂质,对于遇冷结晶的溶液需保温过滤。为了得到好的结晶,常需保温结晶,结晶时间较长。

    酰胺键是构成生物体内蛋白质的重要共价键,是由氨基酸合成多肽、蛋白质类化合物的重要合成方法。本实验所用的方法条件苛刻,不适用于此类目的。

    目前合成多肽的方法主要有液相合成法和固相合成法。在液相肽合成中,每次接肽以后都需要对产物分离纯化或结晶以便除去未反应的原料和副产物。这个步骤相当费时间而且麻烦,因操作带来的损失往往也很大。为了减少这个麻烦并期望能够使接肽反应自动化,麦瑞菲尔德(Merrifield)于1963年发展成功了固相肽合成方法,他用这个方法获得了结晶的LeuAlaGlyVal四肽。与之差不多同时,勒辛格(Letsinger)和柯尔内特(Kornet)也用固相载体经不同的化学途径合成了LeuGly。以后又经过麦瑞菲尔德本人以及其它实验室对这个方法进行不断的改进和完善,使之到今天已经成为多肽和蛋白质合成中的一个常用的技术。为此麦瑞菲尔德获得了1984年诺贝尔化学奖。

    固相合成的主要设计思想是:先将所要合成肽链的羧末端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连,然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应接长肽链。这样的步骤可以重复的多次进行下去,即缩合——洗涤——去保护——中和和洗涤——下一轮缩合,最后达到所需要合成的肽链长度。

    固相合成反应的基础是液相合成。由于在液相合成中最普遍采用的是以羧基活化的方式进行接肽,因此在固相合成中也多同样采用上述的将氨基组分挂在固相树脂上而向氨端伸长肽链的方式,因为这有利于采用过量的活化羧基组分以促使缩合反应接近于完全,而过量的羧基组分则又由于其存在于溶液之中,可以通过过滤和洗涤的方法很容易地除去。

    用于肽合成的高分子载体主要有四类。即不同交联度的聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂;不同比例N,N-乙烯基-双-丙烯酰胺树脂;聚乙二醇;无交联的聚苯乙烯

    历史发展/多肽固相合成法 编辑

    (图)多肽固相合成法多肽固相合成法

    Merrifield所建立的Boc合成法是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基,侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc-氨基酸衍生物共价交联到树脂上,用TFA脱除Boc,用三乙胺中和游离的氨基末端,然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸,最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法。用Boc法已成功地合成了许多生物大分子,如活性酶、生长因子、人工蛋白等。

    多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在,人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽,对于多肽的研究和利用,出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义,而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构;设计新的多肽,用于研究结构与功能的关系;为多肽生物合成反应机制提供重要信息;建立模型以及合成新的多肽药物等。

    多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来,固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程,对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。

    从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来,经过不断的改进和完善,到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术,表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是:先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连,然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应,接长肽链。重复(缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合)操作,达到所要合成的肽链长度,最后将肽链从树脂上裂解下来,经过纯化等处理,即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC(叔丁氧羰基)保护的称为BOC固相合成法,α-氨基用FMOC(9-芴甲氧羰基)保护的称为FMOC固相合成法。

    基本原理/多肽固相合成法 编辑

    (图)多肽固相合成法多肽固相合成法

    多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程,固相合成顺序一般从C端(羧基端)向 N端(氨基端)合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法,从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生,参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的,并且在反应之前必须活化。化学合成方法有两种,即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势,现在大多采用Fmoc法合成,如图:

    具体合成由下列几个循环组成:

    一、去保护:Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂(piperidine)去 除氨基的保护基团。

    二、激活和交联:下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联,形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环:这两步反应反复循环直到合成完成。

    三、洗脱和脱保护:多肽从柱上洗脱下来,其保护基团被一种脱保护剂(TFA) 洗脱和脱保护。

    条件选择/多肽固相合成法 编辑

    (图)Fmoc合成法中的固相载体Fmoc合成法中的固相载体

    将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体,能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求:必须包含反应位点(或反应基团),以使肽链连在这些位点上,并在以后除去;必须对合成过程中的物理化学条件稳定;载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触;另外,载体必须允许提供足够的连接点,以使每单位体积的载体给出有用产量的肽,并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类:聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物,这些树脂只有导入反应基团,才能直接连上(第一个)氨基酸。根据所导入反应基团的不同,又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。BOC合成法通常选择氯甲基树脂,如Merrifield树脂;FMOC合成法通常选择羧基树脂如王氏树脂。

    氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的,形成共价键的方法有多种:氯甲基树脂,通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐或钠盐钾盐铯盐,然后在适当温度下,直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如二氧六环、DMF或DMSO中反应;羧基树脂,则通常加入适当的缩合剂如DCC或羧基二咪唑,使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定;氨基树脂或酰肼型树脂,却是加入适当的缩合剂如DCC后,通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。

    保护脱除/多肽固相合成法 编辑

    (图)Fmoc法固相肽合成多肽链的主要连接是肽键Fmoc法固相肽合成多肽链的主要连接是肽键

    要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽,需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护,同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护,反应完成后再将保护基因除去。同液相合成一样,固相合成中多采用烷氧羰基类型作为α氨基的保护基,因为这样不易发生消旋。最早是用苄氧羰基,由于它需要较强的酸解条件才能脱除,所以后来改为叔丁氧羰基(BOC)保护,用TFA(三氟乙酸)脱保护,但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的肽类的合成。

    1978年,chang Meienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作为α氨基保护基,Fmoc基对酸很稳定,但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脱去,近年来,Fmoc合成法得到了广泛的应用。羧基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法,可通过皂化除去或转变为肼以便用于片断组合;叔丁酯在酸性条件下除去;苄酯常用催化氢化除去。对于合成含有半胱氨酸组氨酸精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说,为了避免由于侧链功能团所带来的副反应,一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。

    保护基的选择既要保证侧链基团不参与形成酰胺的反应,又要保证在肽合成过程中不受破坏,同时又要保证在最后肽链裂解时能被除去。如用三苯甲基保护半胱氨酸的S-,用酸或银盐、汞盐除去;组氨酸的咪唑环用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保护,可通过催化氢化或冷的三氟乙酸脱去。精氨酸用金刚烷氧羰基(Adoc)保护,用冷的三氟乙酸脱去。

    固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致,将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键,要形成酰胺键,经常用的手段是将羧基活化,变成混合酸酐活泼酯、酰氯或用强的失去剂(如碳二亚氨)形成对称酸酐等方法来形成酰胺键。其中选用DCC、hobt或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法接肽应用最广。

    裂解及合成肽链的纯化 BOC法用TFA HF裂解和脱侧链保护基,FMOC法直接用TFA,有时根据条件不同,其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。

    HPLC分析纯化/多肽固相合成法 编辑

    (图)固相多肽合成树脂的特征和进展固相多肽合成树脂的特征和进展

    分析HPLC使用柱子和泵系统,可以经受传递高压,这样可以用极细的微粒(3-10μ m)做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。

    HPLC分两类:离子交换和反相。 离子交换HPLC依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸组成表现出相反电荷。分离是一种电荷相互作用,通过可变PH, 离子强度, 或两者洗脱出多肽,通常, 先用低离子强度的溶液,以后逐渐加强或一步一步加强,直到多肽火柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性PH中带正电来分离。

    反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上,用降低离子强度洗脱, 如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成,这种链长度为G4-G8碳原子。 由于洗脱是一种疏水作用。大的疏水肽用短链柱洗脱好。 然而,总体实践中, 这两类柱互变无多少显著差别,别类载体由碳水化合物构成, 比如苯基。

    典型的操作常由两绶冲剂组成,0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱,那么大小是8×100(3-10μ m)和25×250mm(10μ m)。

    大量各种缓冲剂含许多不同试剂,比如heptafluorobutyric酸,0.1%磷酸, 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸钠/氨,TFA/TEA,磷酸钠或钾,异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂,但要注意一点:硅反相柱料不能长时间暴露于高pH,甚至微碱pH, 因为这样会破坏柱子。

    参考资料/多肽固相合成法 编辑

    [1] 试验方案网 http://www.51protocol.com/tool/sh/58500.html

    [2] 试验方案网 http://www.51protocol.com/tool/sh/58505.html

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