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  • 干血纸片法

    干血纸片法(dried blood spot,DBS),即将全血样品收集在卡纸上,在血样采集方法上比传统方法有一定的优势。它需求较少的血量,可减少动物使用,方便血样采集、存储运输,是罕见疾病筛查过程中的一项有效工具。干血纸片法早在上世纪六十年代就已被用于苯丙酮尿症的新生儿筛查中。随着串联质谱技术等的发展,干血纸片法在遗传代谢类疾病的诊断及筛查中的应用价值日渐突显。

    编辑摘要

    基本信息 编辑信息模块

    中文名: 干血纸片法 英文名: dried blood spot
    定义: 全血样品收集在卡纸上,在血样采集方法上比传统方法有一定的优势

    目录

    原理/干血纸片法 编辑

    干血纸片法的原理是将全血滴加在滤纸片上,干燥后得到干血斑块,经溶剂萃取后,通过荧光反应法、串联质谱法等分析干血斑中待检测组分的信息来反映患者的诊断结果,如病毒DNA含量、代谢产物含量、酶活性等。

    应用范围/干血纸片法 编辑

    截至2015年5月干血纸片法主要应用于代谢相关疾病的筛查、药物动力学研究以及新生儿筛查等。对于遗传代谢性疾病,代谢酶及代谢产物能够较为稳定存在于干血纸片中,因而在对代谢异常类疾病样本进行筛查分析时,干血纸片法能较为准确的反映样本中代谢酶或代谢产物的含量[1]

    优势和局限性/干血纸片法 编辑

    临床应用中的优势和局限性

    优势

    从样本保存的角度上来说,干血斑比全血更为稳定[1][2],所以其储存及运输成本远低于全血。另外,干血纸片需要采集的样本量较少,因此干血纸片在需要多次采样来进行诊断的检测中有着特定的优势。

    由于干血纸片法的简易性和较高的稳定性,在许多大规模疾病筛查中(如新生儿的遗传病筛查)已经显现出来了极为广泛的应用前景。国外已经广泛将干血纸片应用于疾病筛查样本运输中,在一定程度上替代了传统的全血的运输方式[3]。国内也逐渐开始使用干血纸片进行血液制品的运输,多家医院已经使用干血纸片运输血样进行艾滋病(HIV)[4]、丙型肝炎[5]、糖原贮积病如庞贝病等疾病筛查[6]

    局限性

    值得注意的是,干血纸片在临床上的应用仍然存在一定的局限性。对于包括戈谢病在内的遗传代谢性疾病,干血纸片仅能作为高危筛查或者新生儿大规模筛查的手段,确诊仍需要进一步对全血进行酶活性检测(酶学检测是诊断的金标准),并结合基因突变检测完成疾病的诊断。

    应用流程/干血纸片法 编辑

    在戈谢病诊断及筛查中的应用

    戈谢病概况

    溶酶体贮积病(Lysosomal Storage Disorders, LSDs)是一类遗传性代谢性疾病,由于基因突变导致溶酶体内的水解酶异常或者缺失,引起溶酶体功能缺陷,致使溶酶体通路内的代谢物在组织器官贮积。由于大多数的LSDs都是由于溶酶体内酶缺失或者功能异常导致,所以LSDs的主要诊断方式就是检测血液中酶的活性。

    戈谢病(Gaucher Disease, GD),溶酶体贮积病中最常见的一种疾病,是一种由于酸性β-葡萄糖苷酶(Acid β-Glucocerebrosidase, GBA)基因突变引起的常染色体隐性遗传病。由于基因突变,造成体内该酶活性下降,从而导致其底物葡萄糖脂不能被正常降解而在溶酶体中贮积,在多种组织中形成典型的溶酶体贮积细胞即戈谢细胞,导致受累组织器官出现病变,出现脾肿大、血小板减少症等症状。大量研究已经发现酶替代疗法可治疗戈谢病[7]。因此及早诊断是治疗这一疾病的关键。

    干血纸片法结合荧光反应法、数字微流控酶活力检测(Digital Microfluidic Enzyme Assay)、液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)等检测GBA活性是最常用于戈谢病筛查的方法。当前仅有北京协和医院、上海新华医院、广州市妇女儿童医疗中心、华中科技大学同济医学院附属同济医院可进行戈谢病的确诊。因此干血纸片法的简易性和稳定性能为偏远地区的戈谢病患者更快得到确诊提供方便。

    干血纸片法的采样、萃取流程

    干血纸片法样本采集卡样式 干血纸片法样本采集卡样式

    1)在收集卡中填写病人的姓名和采集日期等信息 。由于戈谢病诊断需要检测酶活力,故常采用具有蛋白保存功能的滤纸片进行样本采集,如Whatman 903滤纸片;

    2)采血取样。可使用毛细血管和静脉血(可以使用EDTA或ACD抗凝剂,但应避免使用肝素),注意不要使用含碘的消毒剂,在DBS卡的每个圈中滴一滴血,确保覆盖整个圈切完全渗透该滤纸(血滴仅滴在滤纸的一面,不要在同一滤纸圆圈中重复滴上血液)。

    3)为了保留酶的活性,首先必须在室温下干燥4小时。干燥时保持滤纸悬空,水平固定在桌面边缘,以保证充分干燥,注意使卡片远离直接的热源或日光。为了避免交叉污染,一旦采集血样后,勿将卡片重叠放置。在血斑完全干燥后,使用塑封带将干燥收集卡进行封装,注意不要用手接触血斑,以防样本被污染。样本一般为室温保存及运输,如需长期储存,需深低温(-70度)保存[8][9]

    4)用打孔器在样品区截取一个小圆片,加入溶剂进行洗脱。在打孔器打孔过程中,要严格按照卡纸圆圈进行打孔,防止在打孔过程中样本间相互污染而影响检测结果。洗脱获得的样本可用于后续的仪器检测。

    基于以上操作原理和方法,国内外已经开发了一批自动化的干血纸片法采样系统。通过自动化设备可实现多样本同时采集和萃取分析。

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    参考资料
    [1]^引用日期:2019-04-19
    [2]^引用日期:2019-04-19
    [3]^引用日期:2019-04-19
    [4]^引用日期:2019-04-19
    [5]^引用日期:2019-04-19
    [6]^引用日期:2019-04-19
    [7]^引用日期:2019-04-19
    [8]^引用日期:2019-04-19
    [9]^引用日期:2019-04-19
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