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  • 芯片技术

    芯片技术是一项新兴产业,主要分有基因芯片技术、倒装芯片技术、生物芯片技术、组织芯片技术、蛋白质芯片技术、蛋白芯片技术、DNA芯片技术、液相芯片技术、芯片封装技术。

    编辑摘要

    目录


    简介/芯片技术 编辑

    1990年,著名的人类基因组测序计划(Human Genome Project,HGP)正式启动,从此揭开了基因组时代的序幕。截至2006年8月,美国国立生物技术信息中心(NCBI,National Center for Biot

    基因芯片技术基因芯片技术

    echnology Information)收录的已完成基因组测序的物种数目为389个,正在进行序列拼接且测序完成的有341个,另外还有463个物种正在进行测序。
    基因组测序的完成,为我们提供了生命的第一套密码。从基因组数据中提取蕴藏的大量信息,阐明千变万化的生命现象,是生物学家所面临的更大挑战。众所周知,生命活动的基本单位是细胞,人体中数百种细胞分工合作,形成各种组织器官,最终组合成一个完整的个体。
    生物体中,每个细胞内都有一套完整的基因组,为实现正常生物功能,生物体在不同环境、不同发育阶段,选择不同基因适度表达。即使是最简单的生物也有数百个基因,这些基因遵循一定的表达调控机制,依照特定的时空顺序进行有序的表达。在一个特定的时刻,一个特定细胞中所有表达基因的组合,最终限定了这个细胞的生物学功能。转录组学(Transcriptomics)着重研究高度复杂精确的基因表达调控过程。通过对不同细胞类型之间表达模式差异的研究,转录组学试图从动态的角度刻画出一幅生命活动的“动画”。
    随着基因组数据的增长,DNA芯片(DNA Chip)技术得到广泛应用。DNA芯片也称基因芯片(Gene Chip)、生物芯片(Biochip)或微阵列(Microarray)。20世纪90年代中叶DNA芯片技术出现前,传统分子生物学技术通常只能同时对少数几个基因的表达情况进行研究。决定生物形态或某种生物现象通常是成百上千的基因共同作用的结果,作为一种能够获得大量基因表达图谱的高通量技术,DNA芯片应运而生。芯片技术是一项新兴产业,主要分有基因芯片技术、倒装芯片技术、生物芯片技术、组织芯片技术、蛋白质芯片技术、蛋白芯片技术、DNA芯片技术、液相芯片技术、芯片封装技术。 

    DNA芯片技术/芯片技术 编辑

    DNA芯片原理

     DNA芯片的基本原理与生物学中Southern杂交等实验技术相似,都是利用DNA双螺旋序列的互补性,即两条寡聚核苷酸链以碱基之间形成氢键配对(A与T配对,形成两个氢键;G与C配

    DNA芯片技术DNA芯片技术

    对,形成三个氢键)。DNA芯片通常以尼龙膜玻璃塑料硅片等为基质材料,固着特定序列DNA单链探针(Oligo),并与被检测序列单链cDNA序列互补结合(通常称杂交)。被检测序列用生物素或荧光染料标记,通过荧光染料信号强度,可推算每个探针对应的样品量。一张DNA芯片,可固着成千上万个探针,具体数目则取决于芯片设计和制备方法。
    根据制备方法,DNA芯片主要可以分成三类:
    【1】利用机械装置将cDNA序列或者其他PCR产物点在芯片上作为探针; 
    【2】 利用机械装置将事先合成的寡核苷酸链序列点在芯片上作为探针;
    【3】不事先合成寡核苷酸链,而直接在芯片上通过原位合成技术同时合成所有探针。
    后两种方法,需要综合考虑探针的灵敏性(Sensitivity)和特异性(Specificity),避免非特异性杂交干扰结果;此外还需要考虑GC含量以及退火反应温度,以保证整个芯片可在相同条件下进行杂交实验,所有探针都有比较一致的杂交效率。不同方法生产的芯片探针长度不一,Affymetrix公司的芯片采用短探针,只有25个核苷酸;而NimbleGen公司所用探针相对较长,可达70个核苷酸。一般来说原位合成芯片可在同一张芯片内容纳更多探针。
    除Affymetrix公司生产的芯片外,其他芯片多采用双色杂交系统,即使用Cy5(红)和Cy3(绿)两种染料分别标记所比较两种样品的cDNA序列,然后杂交至同一芯片。实验结果扫描输入计算机,通过染料荧光强度,可间接比较两种样品表达量高低。在一张芯片同时杂交两种样本,可减少用不同芯片所带来的系统误差。

    DNA芯片的应用

    传统基因表达芯片
    传统基因芯片常用于检测一组细胞中全部基因在特定时刻的表达谱。换言之,基因表达产生的mRNA含量,就是DNA芯片要检测的指标。通过将提取的总mRNA反转录为cDNA并杂交到具有不同基因探针的DNA芯片上,就可得到不同基因在不同条件、不同发育阶段下的表达情况。
    通过比较不同条件下的基因表达谱差异,可发现与某种疾病或者特殊处理相关的特定类型基因,并可进一步用于临床诊断或基因工程等。目前,基因表达芯片已广泛用于各个方面,如在医学研究中比较肿瘤细胞与正常细胞间、动物服用药物前后等不同情况下基因表达差异,在植物学研究中研究抗旱、抗病种系与普通种系的基因表达差异等。以双色DNA芯片系统进行基因表达量检测实验为例,一般DNA芯片实验步骤包括以下几步。
    【1】准备杂交样品,一般分别从样品细胞和对照细胞中提取。 
    【2】提取的mRNA通过反转录得到更稳定的cDNA,这个过程中分别对样品细胞和对照细胞加入不同荧光染料(双色芯片实验)或者生物素(单色芯片实验)进行标记。
    【3】两种样品同时杂交到制作好的芯片上,芯片上每个点都与分别标记有两种不同荧光的样品竞争结合。 
    【4】 通过激光扫描仪器可以获得每个点的荧光强度,荧光强度范围为0~65536(216)。这个步骤中应注意实际荧光强度测量值是可以调节的,应该有意识控制大多数样品荧光强度处在总体范围中间偏上位置,太高易产生太多过饱和值,强度超过上限(通常为65536),扫描仪器无法测量;太低则容易受随机误差干扰。例如,若随机误差强度为50,则信号强度为100,则信噪比过低;反之,若信号强度为10000,信噪比大大加强。
    【5】整合两种不同颜色强度可得到虚拟图谱,绿色点表示处理后的细胞中该基因表达量高,红色点反之,黄色点表示处理前后表达水平相当,而黑色点则说明两个颜色标记的样品均无表达。 

    需要注意的是杂交强度不仅代表基因表达水平实际差异,还可能受非特异性杂交影响。为尽量排除这种因素,Affymetirx芯片中设计了不匹配核苷酸探针作矫正依据。此外,染料效率不同带来的系统误差需用均一化方法进行矫正。
    DNA芯片作为一种高通量实验技术,不可避免地存在较大误差,也难以像传统生物学实验那样给出确定结果。因而,最初DNA芯片技术主要用于获得大规模基因表达谱。然而,mRNA表达水平仅仅是基因调控的结果,没有代谢途径等信息,只能得到一个表达谱,而无法解释为什么会有这样的表达谱。比如同样是在光照条件下高表达基因,有些基因可能处于光信号传导通路上游,直接受光诱导;而有些基因则可能由联系光通路以及其他代谢途径的关键转录因子激活。这种信息必须结合其他相关知识及实验才能获得。
    随着基因组测序计划进展,基因注释技术不断提高,以及生物实验所积累的知识不断增加,DNA芯片得到的结果可以从全局角度分析特定生命过程中的问题。例如,通过聚类分析(Clustering)可以把具有相似表达趋势的基因归类,再结合基因注释系统(Gene Ontology)和已知功能基因等注释信息对每个类别进行总结,探讨这种共表达现象在生物学上的意义,进而可以进行代谢途径分析,从全局观点和系统生物学视角探索基因转录调控乃至生命过程机理。DNA芯片高通量的特点,同时也意味着相对高的误差。所以一般来说,需要重复多次实验才能通过统计学方法得到比较接近真实的结果。但是,目前DNA芯片实验成本还相对较高,对实验条件要求也很高,因而如何通过改进统计学模型和方法提高DNA芯片数据处理质量就显得更为必要。

    其他类型芯片及应用

     除了上述专用于基因表达分析的芯片外,近年来还有许多其他类型的芯片出现,如覆盖程度大大增加的覆瓦式芯片(tiling Array)。与传统基因表达芯片不同,覆瓦式芯片的探针选择不再局限于基因编码区,而是基于全基因组序列,从头至尾按一定间隔选择。
    这种芯片的杂交以及扫描与上述传统芯片原理相同,但应用却不完全一样。这种芯片也可用于基因表达分析,但不再局限于比较基因组注释得到的基因表达水平差异,而主要用于寻找普通基因组注释软件无法预测的新基因以及一些非编码RNA区域检测,对基因组注释可以发挥重要作用。其次,由于这种芯片对基因组覆盖程度很高,可用于转录因子在全基因组结合位点寻找、组蛋白修饰、DNA甲基化等表观遗传调控特征分布,以及单核苷酸多态性研究等多个领域。

    芯片数据分析/芯片技术 编辑

    芯片分析概述

    随着基因芯片技术的普及,基因表达数据大量产生,如何充分利用这些数据并从中提取有用的生物学知识,是生物信息学所面临的一个迫切问题。简要来说,生物芯片数据分析流程大体可分成以下几个阶段。

    扫描与图像识别

    一张芯片完成杂交实验,经扫描仪读取后生成图形文件,经过划格(Griding)、确定杂交点范围(Spot Identifying)、过滤背景噪音(Noise Filtering)等图像识别过程,才能最终得到基因表达的荧光信号强度值,并以列表形式输出。

    数据预处理

     由于杂交荧光标记效率或检出率不平衡、位置效应等多种因素,原始提取信号需要进行均衡和修正处理后,才能进一步分析。这一步通常需要先进行背景校正(Background Correction),去除不均匀背景光强影响,然后再进行归一化(Normalization)处理。
    一般来说,对于单色DNA芯片而言,这一步相对容易;而双色DNA芯片则需要考虑不同染料(Cy3、Cy5)对于mRNA染色效率的差异。

    数据分析

     在前一步基础上,需要根据基因表达状况与事先设定的条件,对基因进行分类处理。具体来说,又可分为寻找差异表达基因和寻找共表达基因两种。
    所谓差异表达基因(Differen-tially Expressed Genes),是指在预先设定的不同实验条件下,表达量出现显著差异的基因。而共表达基因(Co-expressed Genes)则是指在不同实验条件下,表达模式或表达量相似的基因。
    实践中,在没有先验知识的情况下,一般是通过聚类来寻找这些基因。如果事先已经有了一组明确的训练集,也可以通过分类来寻找与这组基因具有类似表达模式的其他基因。
    所谓聚类,也称无监督分类(Un-supervised Classification),是指在未设定先验类别的情况下,根据表达模式或表达值相似程度,将基因划分为若干组。而分类则是指在给定已经先验标明类别(如肿瘤、健康)训练集前提下,根据表达模式或表达值相似程度,将被检基因或样本归入预先设定的类别中。
    为确保实验结果可靠性,实际生物学研究中,经常采用RT-PCR之类低通量表达分析手段,对选择出来的基因进行进一步验证。
    值得指出的是,以上给出的只是一个大体流程。实际数据分析过程中,经常需要根据前一步分析结果和实际生物学问题来制定下一阶段分析策略。同时,考虑到基因表达动态性和时间相关性,即使对于同一种细胞类型,不同条件下转录表达情况也会有差异。因此,分析基因表达数据时,必须同时参考具体实验条件的描述,通常称这些描述实验条件的数据为元数据(Meta-data)。典型的元数据包括实验方案、实验材料、图像处理方法和数据归一化方法等信息。

    芯片分析软件包简介

     芯片分析过程繁复,且涉及到复杂的统计计算,需要综合运用多种数学与计算机工具。为方便生物学家研究,相关研究人员已开发了许多专用芯片分析软件。
    【1】Bioconductor
    Bioconductor是基于统计学软件包R的芯片分析软件包,其主要目的是为生物信息学研究人员提供一组表达数据分析工具。Bioconductor的开发起始于2001年,主要由美国Fred Hutchinson肿瘤研究中心、哈佛医学院以及哈佛公共健康研究院开发。
    Bioconductor可支持几乎所有主流芯片数据格式,包括Affymetrix公司的商业化单色寡核苷酸芯片,以及用户自己定制的双色cDNA芯片。Bioconductor通过若干子软件包提供多种主流芯片分析方法,可用于数据预处理、差异表达基因识别以及聚类等常用数据分析。除用于芯片数据分析以外,Bioconductor还可用于SAGE、CGHArray以及SNPArray等其他表达数据分析。
    Bioconductor的源代码完全开放,用户可以方便查看以及修改现有算法及其具体实现模块。因此,Bioconductor也广泛用作其他芯片分析工具的后台支持。
    【2】dChip
    dChip(DNA-Chip Analyzer)由哈佛大学生物统计系Cheng Li、Wing Wong等联合开发,是综合性芯片分析软件。dChip运行在Windows平台上,包括以下功能:
    1) 针对Affymetrix芯片、基于MBEI(Model-based expression indexes)的数据预处理及归一化;
    2) 基于样本比较差异基因识别;
    3)主成分分析(Principal Component Analysis,PCA);
    4) 方差分析(Analysis of Variable,ANOVA);
    5) 时间序列(Time Series)分析;
    6) 层次聚类(Hierarchical Clustering);
    7) SNP array的LOH(Loss-of-heterzygosity)、拷贝数(Copy Number)分析;
    8) 连锁分析(Linkage Analysis)。
    dChip基于Windows的图形用户界面开发,与Bioconductor的命令行界面相比,更便于初学者使用,但它的定制性较弱,不利于进行二次开发。
    最初dChip主要用于Affymetrix的单色寡核苷酸芯片分析,但在最新的版本中(dChip 2006)也开始对双色cDNA芯片的数据分析提供支持。
    【3】TM4
    TM4是一组由TIGR公司开发的生物芯片分析工具包,可同时支持双色和单色 cDNA芯片,以及Affymetrix的单色寡核苷酸芯片分析。TM4提供了对于芯片实验流程的全面支持,大大方便了用户使用。
    TM4主要由四个模块和一个后台数据库组成:
    1) 芯片数据管理工具Microarray Data Manager (MADAM),负责为用户提供统一的操作界面,管理实验流程及产生的数据。为便于数据交换,MADAM将所有数据按照MIAME格式统一存放在后台MySQL数据库中。
    2) 图像分析软件Spotfinder负责从扫描得到的图像中提取基因表达荧光信号强度值。Spotfinder支持多种扫描仪生成的图像文件,同时提供半自动化划格(Griding)及杂交点识别(Spot Identifying)功能。
    3) MIDAS(Microarray Data Analysis System)是数据预处理模块,支持LOWESS、Iterative Linear Regression、Slice Analysis等多种常用归一化算法。同时,MIDAS还支持通过标准的t-检验、MAANOVA、SAM等方法寻找差异表达基因。
    4) MeV(MultiExperiment Viewer)用来进行聚类和分类,以及结果的可视化显示。目前支持包括层次聚类(Hierarchical clustering)、K-mean聚类、自组织图聚类(Self-Organizing Map,SOM)等多种聚类算法,以及支持向量机(Support Vector Machine,SVM)等多种分类算法。
    【4】BASE
    BASE是一个基于Web的芯片数据管理与分析平台。与上述主要基于单机的分析软件包不同,BASE的设计目标是提供一个可以供多人协同工作的平台。因此,BASE在数据管理方面投入了很多精力,将芯片数据管理与芯片数据注释融为一体,用户可以通过浏览器方便地查询实验进度、观察实验结果,并及时和其他相关人员分享信息。
    同时,BASE也提供了一组简单的工具,供研究人员对数据进行一些快速分析。BASE中包含了一个基于Java Applet的三维可视化工具,可供用户从多个角度查看数据分析结果。
    【5】Matlab Bioinformatics Toolbox
    Matlab是经典的科学计算软件,由美国MathWorks公司开发。它集数值运算、符号运算及图形处理于一体,广泛应用于工程和科学计算。类似于R,Matlab的核心部分注重提供一个快速、高效且稳定的平台支持,通过针对不同领域与应用编写特定工具(Toolbox),满足不同客户的专门需求。最新版Matlab 7附带Bioinformatics Toolbox,是Matlab第一个专门针对生物信息应用而开发的工具箱。该工具箱为芯片数据处理提供了归一化和聚类分析,包括层次聚类和K-mean聚类。此外,通过与统计工具箱配合使用,用户还可通过经典的t-检验及ANOVA等方法寻找差异表达基因。与其他专业软件相比(见表1),目前该工具箱芯片数据分析功能还很有限,特别是很多2003年以来发展的新方法都没有包括。
    除了Matlab Bioinformatics Toolbox以外,用于学术研究目的时,上述软件都可以免费获得。 


    倒装芯片技术/芯片技术 编辑

    “倒装芯片技术”这一名词包括许多不同的方法。每一种方法都有许多不同之处,且应用也有所不同。例如,就电路

    倒装芯片技术倒装芯片技术

    板或基板类型的选择而言,无论它是有机材料陶瓷材料还是柔性材料,都决定着组装材料(凸点类型、焊剂、底部填充材料等)的选择,而且在一定程度上还决定着所需设备的选择。在目前的情况下,每个公司都必须决定采用哪一种技术,选购哪一类工艺部件,为满足未来产品的需要进行哪一些研究与开发,同时还需要考虑如何将资本投资和运作成本降至最低额。
    在SMT环境中最常用、最合适的方法是焊膏倒装芯片组装工艺。即使如此,为了确保可制造性、可靠性并达到成本目标也应考虑到该技术的许多变化。目前广泛采用的倒装芯片方法主要是根据互连结构而确定的。如,柔顺凸点技术的实现要采用镀金的导电聚合物或聚合物/弹性体凸点。
    焊柱凸点技术的实现要采用焊球键合(主要采用金线)或电镀技术,然后用导电的各向同性粘接剂完成组装。工艺中不能对集成电路(1C)键合点造成影响。在这种情况下就需要使用各向异性导电膜。焊膏凸点技术包括蒸发电镀化学镀模板印刷喷注等。因此,互连的选择就决定了所需的键合技术。通常,可选择的键合技术主要包括:再流键合热超声键合热压键合瞬态液相键合等。
    上述各种技术都有利也有弊,通常都受应用而驱动。但就标准SMT工艺使用而言,焊膏倒装芯片组装工艺是最常见的,且已证明完全适合SMT。

    焊膏倒装芯片组装技术

    传统的焊膏倒装芯片组装工艺流程包括:涂焊剂布芯片焊膏再流底部填充等。但为了桷保成功而可靠的倒装芯片组装还必须注意其它事项。通常,成功始于设计。
    首要的设计考虑包括焊料凸点和下凸点结构,其目的是将互连和IC键合点上的应力降至最低。如果互连设计适当的话,已知的可靠性模型可预测出焊膏上将要出现的问题。对IC键合点结构、钝化、聚酰亚胺开口以及下凸点冶金(UBM)结构进行合理的设计即可实现这一目的。钝化开口的设计必须达到下列目的:降低电流密度;减小集中应力的面积;提高电迁移的寿命;最大限度地增大UBM和焊料凸点的断面面积。
    凸点位置布局是另一项设计考虑,焊料凸点的位置尽可能的对称,识别定向特征(去掉一个边角凸点)是个例外。布局设计还必须考虑顺流切片操作不会受到任何干扰。在IC的有源区上布置焊料凸点还取决于IC电路的电性能和灵敏度。除此之外,还有其它的IC设计考虑,但晶片凸点制作公司拥有专门的IC焊点与布局设计准则来保证凸点的可靠性,从而可确保互连的可靠性。
    主要的板设计考虑包括金属焊点的尺寸与相关的焊料掩模开口。首先,必须最大限度地增加板焊点位置的润湿面积以形成较强的结合点。但必须注意板上润湿面积的大小应与UBM的直径相匹配。这有助于形成对称的互连,并可避免互连一端的应力高于另一端,即应力不均衡问题。实际上,设计时,通常会采用使板的焊点直径略大于UBM直径的方法,目的是将接合应力集中在电路板一端,而不是较弱的IC上。对焊膏掩模开口进行适当的设计可以控制板焊点位置上的润湿面积。
    既可采用焊膏掩模设计也可采用无焊膏掩模设计,但将这两种方法结合起来的设计是最可靠的设计手段。在相关的电路板图形上使用矩形开口并将焊膏掩模的清晰度也考虑在内即可设计出恰当的板焊点位置。如果设计不合理,一旦组装环境发生变化或机械因数有所改变,IC就会出现焊膏疲劳断裂。采用底部填料的方法的确能够极大地提高倒装芯片元件互连的可靠性,但如果不严格遵循设计准则的话还是不可避免地会产生同样的失效机理。

    晶片的凸点制作/切片

    焊料凸点的作用是充当IC电路板之间的机械互连、电互连、有时还起到热互连的作用。在典型的倒装芯片器件中,互连由UBM和焊料凸点本身构成。UBM搭接在晶片钝化层上,以保护电路不受外部环境的影响。实际上,UBM充当着凸点的基底。它具有极佳的与晶片金属钝化材料的粘接性能,充当着焊膏与IC键合金属之间的焊膏扩散层,同时还为焊膏提供氧化势垒润湿表面。UBM叠层对降低IC焊点下方的应力具有十分重要的作用。
    如前所述,焊料凸点制作技术的种类很多。采用蒸发的方法需要在晶片表面上溅射势垒金属(采用掩模或用光刻作为辅助手段)形成UMB,然后蒸发Sn和Pb形成焊料。在随后的工艺中对Sn和Pb焊料进行再流,形成球形凸点。这一技术非常适用于采用耐高温陶瓷基板的含铅量较高的凸点(相对易熔焊料凸点而言)。但对有机电路板上的SMT应用而言,IC上的高铅焊料凸点还需要采用易熔焊料来形成互连。
    低成本的凸点制作技术,如电镀或模板印刷(与溅射或化学镀UBM相结合)都是目前常用的制作工艺。这些工艺的凸点制作成本要比蒸发低一些,而且在电路上使用易熔焊料还可省去再将其放置到电路板上的那步工艺及其费用。目前生产的其它焊料合金包括无铅焊料、高铅焊料和低α焊料等。
    对电镀凸点工艺而言,UBM材料要溅射在整个晶片的表面上,然后淀积光刻胶,并用光刻的方法在IC键合点上形成开口。然后将焊接材料电镀到晶片上并包含在光刻胶的开口中。其后将光刻胶剥离,并对曝光的UBM材料进行刻蚀,对晶片进行再流,形成最终的凸点。另一种常用的方法是将焊料模板印刷到带图形的UBM(溅射或电镀)上,然后再流。
    控制凸点的最终高度具有十分重要的作用。它可以保证较高的组装成品率。用于监测凸点制作工艺的破坏性凸点切断测试方法常常会使焊膏中产生失效模式,但绝不会对UBM或下面的IC焊点造成这样的结果。
    晶片切割常常被看作是后端组装中的第一步。磨蚀金刚石刀片以60,000rpm的转速进行切片。切割中要使用去离子水以提高切割的质量并延长刀片的寿命。目前,降低单个IC上的屑片缺陷是一项十分紧迫的任务。因为顶部的屑片有可能接近芯片的有源区,背面的屑片对倒装芯片的可靠性极其不利。边缘的断裂,甚至是芯片区内的背面芯片在热应力和机械应力的作用下常会扩展,导致器件的早期失效。

    焊剂/拾装/再流

    完成晶片切割后,可将切分好的单个芯片留在晶片上,也可将其放置到华夫饼包装容器、凝胶容器、Surftape或带与轴封装中。倒装芯片布局设备必须具有处理带凸点的芯片的能力。华夫饼容器适应于小批量需求,或用于免测芯片;带与轴适用于SMT贴装设备;送至贴装设备的晶片较为普遍,且最适合大批量制造应用。
    实际的倒装芯片组装工艺由分配焊剂开始。分配焊剂的方法有多种,包括浸液、挤涂分配、模板印刷、或喷涂等。每一种方法都有其优点和应用范围。贴装设备上通常要装有焊剂或粘接胶浸润组件。这种方法具备将焊剂固定到芯片凸点上的优点。
    控制焊剂膜的高度和盘的旋转速度对批量生产的可重复性十分必要。焊剂分配工艺必须精确控制焊剂的分配量与可重复性。模板印刷焊剂适用于大批量制造,但对逆流设备的要求较高。不管采用哪一种方法,在粘贴倒装芯片器件时都必须考虑材料的特性和所用焊剂的兼容性。
    完成焊剂分配工艺后就可以采用多头高速元件拾装系统或超高精度拾装系统拾取芯片了。为了促进半导体后端制造与EMS组装市场的结合。

    生物芯片技术/芯片技术 编辑

    生物芯片技术是通过缩微技术,根据分子间特异性地相互作用的原理,将生命科学领域中不连续的分析过程集成于

    生物芯片技术生物芯片技术

    芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同,可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。目前,最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的“微阵列(microarray)”,也被称为基因芯片(Gene chip)或DNA芯片(DNA chip)。1998年6月美国宣布正式启动基因芯片计划,联合私人投资机构投入了20亿美元以上的研究经费。世界各国也开始加大投入,以基因芯片为核心的相关产业正在全球崛起,目前美国已有8家生物芯片公司股票上市,平均每年股票上涨75%,据统计全球目前生物芯片工业产值为10亿美元左右,预计今后5年之内,生物芯片的市场销售可达到200亿美元以上。

    生物芯片技术简介

    生物芯片技术通过微加工工艺在厘米见方的芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子,它可以对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行集成,从而实现对基因、配体、抗原等生物活性物质进行高效快捷的测试和分析。它的出现将给生命科学医学化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品环境监督等众多领域带来巨大的革新甚至革命

    生物芯片技术研究的背景

    原定于2005年竣工的人类30亿碱基序列的测定工作(Human Genome Project,基因组计划)由于高效测序仪的引入和商业机构的介入已经完成,。怎样利用该计划所揭示的大量遗传信息去探明人类众多疾病的起因和发病机理,并为其诊断、治疗及易感性研究提供有力的工具,则是继人类基因组计划完成后生命科学领域内又一重大课题。现在,以功能研究为核心的后基因组计划已经悄然走来,为此,研究人员必需设计和利用更为高效的硬软件技术来对如此庞大的基因组及蛋白质组信息进行加工和研究。建立新型、高效、快速的检测和分析技术就势在必行了。这些高效的分析与测定技术已有多种,如DNA质谱分析法,荧光单分子分析法,杂交分析等。其中以生物芯片技术为基础的许多新型分析技术发展最快也最具发展潜力。早在1988年,Bains等人就将短的DNA片段固定到支持物上,以反向杂交的方式进行序列测定。当今,随着生命科学与众多相关学科(如计算机科学、材料科学、微加工技术、有机合成技术等)的迅猛发展,为生物芯片的实现提供了实践上的可能性。生物芯片的设想最早起始于80年代中期,90年代美国Affymetrix公司实现了DNA探针分子的高密度集成,即将特定序列的寡核苷酸片段以很高的密度有序地固定在一块玻璃、硅等固体片基上,作为核酸信息的载体,通过与样品的杂交反应获取其核酸序列信息。生物芯片由于采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概念,因此具有高效、高信息量等突出优点。

    基因芯片技术的前景

     基因芯片用途广泛,在生命科学研究及实践、医学科研及临床、药物设计、环境保护、农业军事等各个领域有着广泛的用武之地。这些无疑将会产生巨大的社会和经济效益。有着广泛的经济、社会及科研前景。因此,国际上一些著名的政治家, 投资者和科学家均看好这一技术前景。认为基因芯片以及相关产品产值有可能超过微电子芯片, 成为下一世纪最大的高技术产业,具有巨大的商业潜力。
    【1】社会前景
    基因芯片可为研究不同层次多基因协同作用提供手段。这将在研究人类重大疾病的相关基因及作用机理等方面发挥巨大的作用。人类许多常见病如肿瘤、心血管病、神经系统退化性疾病、自身免疫性疾病及代谢性疾病等均与基因有密切的关系。
    生物芯片能为现代医学发展提供强有力的手段,促进医学从“系统、血管、组织和细胞层次”(第二阶段医学)向“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次”(第三阶段医学)过渡,使之尽快进入实际应用。
    DNA芯片技术可用于水稻抗病基因的分离与鉴定。水稻是我国的主要粮食作物,病害是提高水稻产量的主要限制因素。利用转基因技术进行品种改良,是目前最经济有效的防治措施。而应用这一技术的前提是必须首先获得优良基因克隆,但目前具有专一抗性的抗病基因数量有限,限制了这一技术的应用。而基因芯片用于水稻抗病相关基因的分离及分析,可方便的获取抗病基因,产生明显的社会效益。
    在医药设计、环境保护、农业等各个领域,基因芯片均有很多用武之地,成为人类造福自身的工具
    【2】经济前景
    美国总统克林顿在1998年1月对全国的演讲中指出“未来十二年, 基因芯片将为我们一生中的疾病预防指点迷津”。1998年6月27日华盛顿邮报在报道Motorola进入基因芯片领域时, 认为这将造福于子孙后代。美国“Fortune”杂志在1997年3月重点介绍了基因芯片技术, 论述了未来产业化的前景,该文预测“在2005年仅仅在美国用于基因组研究的芯片销售额将达约50亿美元, 2010年有可能上升为400亿美元”。这还不包括用于疾病预防及诊治以及其它领域中的基因芯片,这部分预计比基因组研究用量还要大上百倍。
    由于生物芯片的重大意义和巨大的商业潜力, 北美和欧洲许多国家的政府和公司投入大量人力物力来推动此项研究工作。如美国的国立卫生研究院、商业部高技术署、国防部、司法部和一些大公司以及风险投资者投入了数亿美元的巨资。基因芯片以及相关产品产业有可能成为下一世纪最大的高技术产业之一。
    【3】社会前景
    高密度芯片的批量制备技术:利用平面微细加工技术,结合高产率原位DNA合成技术,制备高密度芯片是重要的发展趋势。
    高密度基因芯片的设计将会成为基因芯片发展的一个重要课题,它决定基因芯片的应用和功能。利用生物信息学方法,根据被检测基因序列的特征和检测要求,设计出可靠性高,容错性好,检测直观的高密度芯片是决定其应用的关键。
    生物功能物质微阵列芯片的研制:发展高集成度的生物功能单元的微阵列芯片,特别是发展蛋白质、多肽、细胞和细胞器、病毒等生物功能单元的高密度自组装技术,研制和开发有批量制备潜力的生物芯片制备技术。

    表达谱基因芯片

     表达谱基因芯片是用于基因功能研究的一种基因芯片。是目前技术比较成熟,应用最广泛的一种基因芯片

    检测原理

    用不同的荧光染料通过逆转录反应将不同组织或细胞的mRNA分别标记成不同的探针,将探针混合后与芯片上的基因进行杂交、洗涤,用特有的荧光波长扫描芯片,得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱图片,再通过计算机分析出这些基因在不同组织中表达差异的重要信息。是基因功能研究的一种重要手段。

    应用意义

     对来源于不同个体(正常人与患者)、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激(包括不同诱导、不同治疗阶段)下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交,可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断,迅速将某个或几个基因与疾病联系起来,极大地加快这些基因功能的确立,同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。所以,无论何种研究领域,利用表达谱基因芯片可以获得大量与研究领域相关的基因,使研究更具目的性和系统性,同时也拓宽研究领域。

    表达谱基因芯片与传统Northern Blot比较

     采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的Northern Blot相比有许多重要的优点:
    检测系统的微型化,对样品等需要量非常小
    同时研究上万个基因的表达变化,研究效率明显提高
    能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系,从而研究基因与基因之间内在的作用关系
    检测基因表达变化的灵敏度高,可检测丰度相差几个数量级的表达情况
    节约费用和时间

    制作技术

     光引导原位合成
    原位合成适于制造寡核苷酸和寡肽微点阵芯片,具有合成速度快、相对成本低、便于规模化生产等优点。照相平板印刷技术是平板印刷技术与DNA和多肽固相化学合成技术相结合的产物,可以在预设位点按照预定的序列方便快捷地合成大量寡核苷酸或多肽分子。在生物芯片研制方面享有盛誉的美国Affymetrix公司运用该技术制造大规模集成Genechip。原位合成后的寡核苷酸或多肽分子与玻片共价连接。它用预先制作的蔽光板和经过修饰的4种碱基,通过光进行活化从而以固相方式合成微点阵。合成前,预先将玻片氨基化,并用光不稳定保护剂将活化的氨基保护起来。聚合用单体分子一端活化另一端受光敏保护剂的保护。选择适当的挡光板使需要聚合的部位透光,不需要发生聚合的位点蔽光。这样,光通过挡光板照射到支持物上,受光部分的氨基解保护,从而与单体分子发生偶联反应。每次反应在成千上万个位点上添加一个特定的碱基。由于发生反应后的部位依然接受保护剂的保护,所以可以通过控制挡光板透光与蔽光图案以及每次参与反应单体分子的种类,就可以实现在特定位点合成大量预定序列寡核苷酸或寡肽的目的。由于照相平板印刷技术每步的合成效率较低(95%)[2],合成30nt的终产率仅为20%,所以该技术只能合成30nt左右长度的寡核苷酸。在此基础上,有人将光引导合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相结合,以酸作为去保护剂,将每步合成产率提高到99%,但制造工艺复杂程度增加了许多[3]。所以如何简便地提高合成产率是光引导原位合成技 术有待解决的问题。

    打印原位合成

    压电打印原位合成的方式类似于喷墨打印机,合成原理与传统的核酸或寡肽固相合成技术相同。合成过程为:合成前以与光引导原位合成类似的方式对芯片片基进行预处理,使其带有反应活性基团,例如伯氨基。同时,将合成用前体分子(DNA合成碱基、cDNA和其它分子)放入打印墨盒内,由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动,并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的碱基合成前体试剂(不足纳升)喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。由于脱保护方式为酸去保护,所以每步延伸的合成产率可以高达99%,合成的探针长度可以达到40~50nt。以后每轮偶联反应依据同样的方式将需要连接的分子喷印到预定位点进行后续的偶联反应。类似地重复此操作可以在特定位点按照每个位点预定的序列合成出大量的寡核苷酸探针。

    点 样 法

    点样法在多聚物的设计方面与原位合成技术相似。只是合成工作用传统的DNA、多肽合成仪或PCR扩增或体内克隆等方法完成。大量制备好的核酸探针、多肽、蛋白等生物大分子再用特殊的自动化微量点样装置将其以较高密度互不干扰地印点于经过特殊处理的玻片、尼龙膜、硝酸纤维素膜上,并使其与支持物牢固结合。支持物需预先经过特殊处理,例如多聚赖氨酸或氨基硅烷等。亦可用其它共价结合的方法将这些生物大分子牢牢地附着于支持物上。现在已经有比较成型的点样装置出售,例如美国Biodot公司的“喷印”仪以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”仪。这些自动化仪器依据所配备的“打印”或“喷印”针将生物大分子从多孔板吸出直接“打印”或“喷印”于芯片片基上(见下图)。“打印”时针头与芯片片基表面发生接触而“喷印”时针头与片基表面保持一定的距离。所以,“打印”仪适宜制作较高密度的微阵列(例如2500点/cm2),“喷印”法由于“喷印”的斑点较大,所以只能形成较低密度的探针阵列,通常400点/cm2。点样法制作芯片的工艺比较简单便于掌握、分析设备易于获取,适宜用户按照自己的需要灵活机动地设计微点阵,用于科研和实践工作。 
    目前,除了在生物芯片研制方面享有盛誉的Affymetrix公司等个别公司使用原位合成技术制造芯片外,大多中小型公司普遍采用点样技术制作生物芯片。

    检测和分析

    检测的原理
    荧光标记和检测是利用荧光标记的DNA碱基在不同的波长下吸收和发射光。在微阵列分析中,多色荧光标记可以在一个分析中同时对二个或多个生物样品进行多重分析,多重分析能大大地增加基因表达和突变检测结果的准确性,排除芯片与芯片间的人为因素。荧光为基础的分析使得利用一些先进的数据获得技术成为可能,包括共聚焦扫描的CCD照相技术。用于芯片制备的无孔基质表面使得芯片检测中的生化反应大大受益。玻璃基质所需的反应体积(5-200ul)比传统的分析要小的多(5-50ml),小反应体积降低了试剂的消耗,增加了微阵列分析中核酸的反应物的浓度(0.1-1um),相对于传统分析(0.1-4PM)增加100000倍之多,浓度的增加又能加速杂交的速度,从而减少获得强荧光信号的时间,并可用盖玻片封闭杂交槽进行杂交反应。 对于以核酸杂交为原理的检测技术,主要过程为:首先用生物素标记经扩增(也可使用其它放大技术)的靶序列或样品然后再与芯片上的大量探针进行杂交。用链霉亲和素(streptavidin)偶联的荧光素(常用的荧光素还有lassamine 和phycoerythrin)作为显色物质,图象的分析则用落谢荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或其它荧光显微装置对片基扫描,由计算机收集荧光信号,并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。由于完全正常的 Watson-Crick配对双链要比具有错配(mismatch)碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性,所以,前者的荧光强度要比后者强出5-35%。从这一点来说,该检测方法是具有一定特异性的,而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。

    荧光探针

     目前用荧光探针作为检测信号的仪器,主要是考虑荧光标记所要检测的DNA的效率,以及荧光探针本身的发光效率和光谱特性。
    (一)PCR过程中的DNA标记
    【1】末端标记:在引物上标记有荧光探针,在DNA扩增过程时,使新形成的DNA链末端带有荧光探针。
    【2】随机插入:选择四种缄机基,使其中一种或几种挂有荧光探针,在PCR过程中,带有荧光探针的碱基和不带荧光探针的碱基,同时参与DNA链的形成。由于带有荧光探针的碱基,可能影响PCR的产物,因此,需要调整荧光标记的碱基与未标记的碱基比率,以使得PCR产量和带有荧光探针的碱基在DNA的插入率达到一个平衡的水平,使杂交信号最强。
    (二)RNA转录过程的荧光探针标记
    某一种碱基标记有荧光,但要求该种碱基标记与非标记按一定比率混合,以达到最佳转录效果。
    (三)荧光探针的选择
    主要考虑以下几个因素:
    荧光探针的激发和发射频谱
    荧光探针的发光效率;
    荧光探针对PCR或逆转录效率的影响;
    不同荧光探针的发射光谱是否有重叠。
    常用的荧光探针:FITC,CY-3,ALEAX488,CY-5,ALEAX564

    聚焦扫描和CCD扫描仪

     一旦荧光标记样品和微阵列反应后,未结合的成分就可洗去,结合到芯片的样品可通过荧光检测装置进行检测。聚焦扫描仪和CCD相机均已成功地应用于芯片的检测。聚焦扫描主要是利用玻璃基质小区域(约100um2)的激光发晒透镜(或两者)使整个影像聚集,每个位点上带荧光的样品发射的光通过一系列的反光镜,光片和晶体后与不要的光分开,然后被光电倍增管(或一种类似的装置)转换成一种电信号。聚焦扫描聚焦数据的速度(1-5min)要比传统实验中的放射自显影快的多(1-10天),快速的荧光检测技术是芯片检测技术的一次革命。CCD相机利用许多与聚焦扫描仪相同的原理聚焦荧光影像。

    生化反应

     杂交反应概述
    该过程指将从生物样品分离到的蛋白、DNA或RNA样品与生物芯片进行反应,从固定于芯片的探针阵列得到样品的序列信息。由于玻片本身的荧光本底很低,所以可用荧光标记的方法来对生物芯片实施检测和分析,同时具有快速、精确和安全等优点。而且,还可用多个荧光素进行标记以实现一次性分析多个生物样品。玻片作为支持物还可使反应体积缩小到5-200μl,而通常的杂交反应体积为5-50ml。这样一方面节约了试剂,同时还可以提高反应试剂的有效浓度(0.1-1μM),是常规检测(0.4-4pM)的一万倍。因此促进了杂交速度减少了杂交时间,并可取得较强的荧光信号。

    样品的制备

    核酸样品
    RNA样品通常需要首先逆转录成cDNA并进行标记后才可进行检测。目前,由于检测灵敏度所限,尚难以普通探针对极少量的核酸分子进行杂交和检测,所以需要对样品或后续测试信号进行适当的放大。多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当程度的扩增,例如通过PCR方法,以使样品核酸的拷贝数有所提高达到检测的灵敏度。但用DNA芯片进行检测分析时需要对样品大量的DNA片段进行扩增和标记,所以需要同时对样品核酸分子大量的区域进行扩增,这是一项工作量非常巨大的工作。顺应这一要求出现了许多解决办法,并在不同程度上减轻了工作量。例如,Mosaic Technologies公司引入的固相PCR方法,将多对引物固定于支持物上(其位置和序列信息预定),以类似于原位PCR的方式一次性对样品多个片段进行扩增和放大,而且不会由于引物种类过多而出现相互间的竞争和抑制(这种情况曾出现于多重PCR中)。引物具有较强的特异性,扩增反应也不存在交叉污染,因而省略了处理常规多重和多个PCR反应的繁琐工作。再如,Lynx Therapeutics公司引入的大规模并行克隆(massively parallel solid-phase cloning),可在一个样品中同时对数以万计的DNA片段进行克隆,且无需单独处理和分离每个克隆。
    除了检测前对样品分子的放大外,通常仍需要有高灵敏度的检测设备来采集、处理和解析生物信息。但,亦有不经过对样品的扩增和放大而直接应用特殊处理的探针,例如分支探针技术,而达到较高的检测灵敏度水平。这种方法的原理是,设计具有庞大分支结构的分支核苷酸探针,分支末端以酶标记。这样,经过分支核苷酸与酶的双重放大作用而将标本杂交时极弱的信号转换为较强的化学信号。该技术比较成功的例子就是HCV与HBV的检测。它的最大优点在于其操作简便,具有较高的灵敏度,同时也可以保证检测结果的特异性[2]。当然,由于不同检测方式的灵敏度不同对于样品的处理和扩增情况的要求亦有所不同,具体的处理和放大方法仍需根据实际情况进行选择。
    蛋白及其它生物样品
    同样,基于生物大分子相互作用原理的生物芯片在检测时生物样品的处理遵循相似的方式,即信号的放大和样品的标记。例如,蛋白芯片在进行检测和分析时,可以将待分析的蛋白样品用荧光素或其它物质进行标记,然后与生物芯片上的生物大分子进行相互作用,最后依据标记物质的不同采取相应的检测方式采集和分析样品和芯片上生物大分子相互作用的结果。对与非核酸类的生物大分子,存在的问题是有时不便于对其进行扩增和放大,因为其它生物大分子的结构相对比较复杂不能进行简便的克隆或扩增。所以,这就向检测的灵敏度提出了更高的要求。其它生物大分子的检测和分析类似与蛋白分子。例如核酸与蛋白的相互作用,配体间的相互作用,糖与蛋白的相互作用等。

    组织芯片技术/芯片技术 编辑

    组织芯片(Tissue Microarray)技术是90年代末期才刚刚兴起的高科技生物技术,它是将数十个甚至数千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上所形成的组织微阵列,简称组织芯

    组织芯片技术组织芯片技术

    片,是DNA芯片技术的发展和延伸。组织芯片为医学分子生物学特别是分子流行病学提供了一种高通量、大样本以及快速的分子水平的分析工具。组织芯片与基因芯片蛋白芯片的有机结合,对新基因的发现、基因的扩增与表达以及蛋白质表达谱在组织中的分布研究均有着十分重要的作用。它克服了传统病理学方法和DNA芯片技术中存在的某些缺陷,使人类第一次有可能利用成百上千份自然或处于疾病状态下的组织标本,同时研究某一个特定基因和基因所表达的相应产物,这对人类后基因组学的深入研究与发展,特别是对研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的相关关系,疾病的分子诊断、预后指标的确定、治疗靶点的定位、治疗效果的预测、抗体和药物的筛选以及基因治疗的研发等方面均有着十分重大的实用价值。组织芯片技术可以广泛地与DNA、RNA、蛋白质、抗原抗体细胞微生物、传统的病理学技术、组织化学免疫组织化学原位杂交原位PCR原位RT-PCR原位DNA合成等技术相结合,分别在基因、转录和表达产物的生物学功能这三个水平上进行研究。组织芯片技术的广泛应用将会极大地促进现代医药学、基因组学和后基因组学研究的深入发展,并有可能出现人类医学研究史上的重大突破。
    随着人类基因组测序工作的完成,美国已经制定了以研究基因功能为主要目标的功能基因组启动计划,这一计划的启动和完成与组织芯片技术密切相关,所以简便的、快速的、先进的组织芯片技术就显得极为重要。目前,世界上尚无系统化、产业化的组织芯片研发与生产基地,此时在中国开展组织芯片技术的研究、开发、产业化生产以及实际应用等工作,不但会极大的促进中国生物医学研究的快速发展,而且对世界生物医学的发展也会产生巨大的影响。本项目旨在跟踪国际组织芯片技术和产业化技术的发展动向,在组织芯片的主流方向上开展创新研究,直接与世界最新组织芯片技术接轨和实现我国生物科技跨越式发展。在中国组建华人疾病相关的组织库、组织芯片库、生物信息数据库基地,不仅符合中国目前制定的科技兴国的发展方向,并且可以有力地推动中国功能基因组学的研究与发展,使我国在这一领域达到与世界同步甚至处于领先的水平。
    组织芯片技术从发明到目前为止只有短短不到三年的时间。目前仍处于产品研发阶段,其中许多相关技术及设备在美国乃至全世界来讲均属全新的高科技范畴,更没有相关产品标准。为使这种高科技产品在中国能够尽快投产以及顺利推广,经过超英生物有关技术人员的研发,2002年4月组织芯片的企业标准被陕西省质量技术监督局批准备案。为了制订出更加完善的组织芯片地方、国家乃至世界标准,从而使组织芯片的生产进一步达到产业化水平,超英生物通过引智工作,邀请美国有关生物医学技术研发及管理专家定期分批来华进行具体工作的指导,协助建立组织芯片主要质控及标准生产流程,解决人工智能生物网控技术中存在的问题等。

    蛋白质芯片技术/芯片技术 编辑

    项目简介

    蛋白质芯片技术是一种新型蛋白质分析技术,基于1995年所提出的光学生物传感器的概念,可以在很小的表面积上,通过表面格式化和表面改性,以阵列式集成多种蛋白质活性,利用生

    蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术

    物分子的特异结合性和高分辨的光学成像相结合,仅需微量生理或生物采样,即可以同时检测、识别和纯化不同的生物分子和研究分子间的相互作用。无需预处理和样品标记,可以直接测量像血浆、尿、唾液、淋巴液和细胞裂解液等生理样品。它的高空间分辨率和高通量的特点,可以同时完成多元分析物或多样本的重复性分析,具有快速和高复现的特点。此芯片技术可用于快速、原位的蛋白质医学诊断,药物筛选和蛋白质功能分析。

    蛋白质芯片研究的主要内容及研制过程

    概括地讲,蛋白质芯片技术主要包括五部分内容:1)芯片设计;2)配基装配;3)芯片反应器;4)芯片信号采样和处理;5)芯片数据库。
    蛋白质芯片是一种蕴含多学科知识的系统工程,为蛋白质分析和检测提供新型技术平台。它不仅仅局限于蛋白质检测,还可以用于蛋白质识别,特意位点研究、药物筛选,以至蛋白纯化等。根据用途,进行蛋白质芯片的设计。

    蛋白质芯片的特点

    【1】 直接测量非纯化分析物
    在进行生物分子的特异性结合研究时,可以直接测量非纯化分析物。
    【2】多元样品同时检测
    由于观测的样品面积大,所以能够用于多元样品观察,在同一表面上可以同时观察几个、几十个、上百个以至更多样品单元。此技术可以同时检测体液中的多种蛋白质,可以同时测量多对生物分子:包括蛋白质、核酸、多糖、磷脂、甚至生物小分子,以及侯选药物的分子间相互作用的情况。它提供了同时分析多元分子溶液综合信息和多样品检测的技术手段。
    【3】样品用量少
    采用了可以达到次单分子膜层分辨能力的光学成像技术和集成蛋白质芯片技术,样品用量仅在10微升量级。
    【4】样品无需任何标记物
    直接测量生物分子的特异性结合所形成的生物分子复合物,并不需要象酶联免疫或放射免疫法那样对生物分子作标记,不会对待测生物分子活性造成任何扰动和损伤。 
    【5】 实时检测生物分子相互作用的动态过程
    可以实时测量多对生物分子的分子间相互作用过程,如分子间是否存在特异性结合、结合的强度和速度、解离的快慢以及结合部位的分析,可以获得生物分子反应的动力学信息。
    【6】具有分辨和排除干扰信号能力
    面阵式芯片测量具有分辨和排除干扰信号能力。
    【7】检测速度快
    电子图像采样具有快速摄取图像的能力,为生物分子动力学研究提供了可能。
    【8】结果直观
    检测结果均以数字图像形式输出,可以进行定性和定量测量。

    主要应用领域

    【1】蛋白质的结构功能研究
    【2】医学诊断和医疗
    【3】新药开发
    【4】生物工业等

    我国自主开发专利产品蛋白芯片技术/芯片技术 编辑

    我国自身免疫性疾病发病率逐年增高,早期诊断检测尤为重要,由我国自主开发的专利产品蛋白芯片技术“微阵列酶联免疫法”的问世,一次性一个多小时就得出了传统试剂多次数小时

    蛋白芯片蛋白芯片

    的检测结果。
    如何快速、准确地得出与自身免疫性疾病相关的6种特异性自身抗体指标,我国自主研发的蛋白芯片产品“自身免疫性疾病抗体谱诊断试剂盒(微阵列酶联免疫法)”在临床上作出了响亮回答!北京华大吉比爱生物技术有限公司副总经理牟峰博士12月8月告诉记者:几个月前,该产品送到北京某医院进行临床验证,医院开始不感兴趣,认为蛋白芯片属于高精尖技术,只用于科研领域,还没有用于临床。可医院对比试验几天后就急切地来电说:“你们一旦拿文号就赶紧将产品送来吧,它可省我们的心了。”原来他们每天检测数十份患者样本,一项项指标做常规检查,从早忙到晚,而用蛋白芯片技术不到半天就做完了。
    日前,该产品已获得国家食品药品管理局的市场准入批文。“我国每年约50万人发生系统性自身免疫病。早期检测诊断的需求不断增加,试剂用量每年以10%—15%的速率增长,可国内市场相关自身抗体检测试剂盒全部为进口试剂,又缺乏规范和统一标准,且敏感性及特异性不一,不利于疾病的早期诊断。”谈起蛋白芯片的研发,牟峰博士感慨颇多,“SARS发热门诊也给了我们启发,当时一旦受检者体温超过38℃后就被隔离;但普通的呼吸道疾病,如流感、呼吸道合胞、腺病毒等感染均可导致发烧症状;鉴别性诊断若能快速、一次性反应结果,就可大大避免资源浪费和交叉感染,临床迫切需要这样的检测技术。”对此,华大吉比爱公司成立了专门的研发部门,联手北京华大基因研究中心共同攻关。他们借鉴在基因组学领域得到广泛应用的DNA芯片的理念;结合临床上常用
    的酶联免疫技术成功开发了芯片技术和ELISA技术的结晶——微阵列酶联免疫技术。
    该技术在保持了ELISA方法学的成熟、方便、自动化程度高的基础上,又具有芯片技术的高通量、低成本、高平行、微型化等特点。临床诊断上,可同时对单个样本进行多种疾病指标的检测;样品用量小;灵敏度和可靠性更高;检测成本低,自动化程度高;利于大规模推广应用。历时3年的攻关,课题人员在酶联免疫吸附试验技术和微阵列技术的基础上,终于形成新一代检测技术体系———微阵列酶联免疫技术,建立了蛋白芯片技术平台。
    2006年9月,自身免疫性疾病ENA抗体谱测定试剂盒(微阵列酶联免疫法)研制成功,并经国家药品生物制品检定所检定合格;日前又获得了国家食品药品管理局的市场准入批文。据介绍,要得出人体6项常规检测指标,传统ELISA一次1—2小时实验,每孔只得一个结果,共需10多个小时,而蛋白芯片技术一次试验每孔可得最多24个结果,也就是说只须1次性1个多小时。蛋白芯片的问世,备受国内专家肯定,称其为“临床诊断的好助手”。临床上它可同时分别检测与系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病、干燥综合征、系统性硬化、多发性肌炎/皮肌炎等自
    身免疫性疾病相关的6种特异性自身抗体。
    专家称,自身免疫病早期诊断率的提高,可提高患者的病情控制率,减少严重并发症的发生,改善患者生存质量。经鉴定,蛋白芯片技术处于国际领先地位,具有良好的社会效益和广阔的应用前景。国外一家媒体报道称:蛋白芯片检测技术在快速检测、多项目联合检测上具有无可比拟的优势,它将引领体外诊断试剂行业的技术革命。记者了解到,华大吉比爱公司10多年来一直致力于诊断试剂的研发、生产及销售,并在分子生物学、医学等领域提供各种服务,主要产品已占据10%—20%的市场份额。公司承担国家“九五”科技攻关、国家863等重大课题;1995年、1999年、2003年、2006年分别成功研制艾滋病、梅毒、SARS、蛋白芯片等的相关诊断技术及产品,受到国家领导人和国家相关部委领导的高度赞扬!蛋白芯片技术的突破,是他们在探索基因组学的基础上对临床诊断技术的
    又一次飞跃。
    目前,他们利用蛋白芯片技术平台,瞄准了结核肿瘤标志物、HPV等多种疾病相关检测产品等课题,使蛋白芯片能够快速进入到临床应用。

    液相芯片技术/芯片技术 编辑

    液相芯片是20世纪90年代中期发展起来的被喻为后基因组时代的新型芯片技术,具有高通量、灵活、快速、准确、重复性好、操作简便等众多优点,可用作蛋白质和核酸等生物分子的高

    液相芯片技术
液相芯片技术

    通量检测平台。液相芯片,也称为微球体悬浮芯片(suspension array,liquid chip),是基于xMAP(flexible MultiAnalyte Profiling)技术的新型生物芯片技术平台,它是在不同荧光编码的微球上进行抗原、抗体、底物、配体受体的结合反应及核酸杂交反应,通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的,一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应,是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。迄今为止十年时间,全球已有数百套基于xMAP技术的检测平台用于免疫学、蛋白质、核酸检测、基因研究等领域,该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具,也是最早通过美国食品与药物管理局(FDA)认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。

    液相芯片技术的原理/芯片技术 编辑

     液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球(直径5.5~5.6 μm)为主要基质构成,每种微球上固定有不同的探针分子,将这些微球悬浮于一个液相体系中,就构成了一个液相芯片系统,利用这个系统可以对同一个样品中的多种不同分子同时进行检测,这种被称之为xMAP的检测技术是1997年由美国Luminex公司开发出来的。 在液相系统中,为了区分不同的探针,每一种固定有探针的微球都有一个独特的色彩编号,或称荧光编码。在微球制造过程中掺入了红色和橙色两种荧光染料(这两种染料各有10种不同区分),从而把微球分为100种不同的颜色,形成一个具有独特光谱地址的含有100种不同微球的阵列。不同颜色微球在分类激光激发下产生的荧光互不相同,这种分类荧光是识别不同微球的唯一途径。利用这100种微球,可以分别标记上100种不同的探针分子。
    检测时先后加入样品和报告分子与标记微球反应,样品中的目的分子(待检测的抗原或抗体、生物素标记的靶核酸片段、酶等)能够与探针和报告分子特异性结合,使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白,随后利用仪器(如Luminex 100)对微球进行检测和结果分析。Luminex 100采用微流技术使微球快速单列通过检测通道,并使用红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测。红色激光可将微球分类,从而鉴定各个不同的反应类型(即定性);绿色激光可确定微球上结合的报告荧光分子的数量,从而确定微球上结合的目的分子的数量(即定量)。因此,通过红绿双色激光的同时检测,完成对反应的实时、定性和定量分析。

    液相芯片技术的优点

    液相芯片技术最突出的优点在于:仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中的多种不同目的分子,即多重检测(multiplexing)。具体说来,与常规免疫学或核酸检测方法相比,液相芯片技术具有以下显著优点。 
    【1】 高通量
    可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行实时、定性、定量分析。从理论上说,如果不存在交叉反应,检测的通量等于微球的种类数,目前最多可达到100种。这远胜过一次只能检测一个项目的传统免疫分析法。 
    【2】 样本用量少
    由于在同一个反应孔中可以同时完成100种不同的生物学反应,所以大大节省了样本用量,少至1μl的样本即可检测,非常适合分析小体积稀有样品。
    【3】操作简单、快速
    由于是基于液相反应动力学,因此反应速度快,孵育时间比传统的固相检测短。进行免疫学分析时,若使用高亲和力抗体,2~3 h内即完成检测,而核酸杂交分析在PCR扩增后1 h内可得到结果。 
    【4】 灵敏度高
    微球表面积大,每个微球上可包被100 000个捕获抗体,如此高密度的捕获抗体保证了能够最大程度地与样本中的抗原分子结合,提高检测灵敏度。最低检测浓度可达到0.1 pg/ml. 
    【5】 检测范围广
    可达3~5个数量级(如BioRad公司细胞因子检测试剂盒的检测范围达到0.2~32 000 pg/ml,样品无需浓缩或稀释。
    【6】特异性强
    无需洗涤就能够自行将和微球结合的与未结合的分子区分开来,只读取单个微球上的荧光信号,信噪比好。
    【7】准确性高
    微球上的报告分子荧光强度与结合的待测分子成正比。由于液相芯片技术的检测范围大,因此不需要象ELISA检测中那样需将样本多倍稀释,从而减小了误差。
    【8】重复性好
    这是由于:第一,与ELISA依靠酶放大作用的比色读数相比,液相芯片技术中的荧光读值更加直接、稳定、灵敏;第二,每种微球检测100个,最终取荧光强度的中值作为结果,这相当于对每个样本重复检测了100次,而ELISA仅为双复孔或三复孔,因此液相芯片检测结果的准确性和重复性是ELISA无法比拟的。 
    【9】 费用低
    同时检测一个样本中的多项指标可节约时间、样本、试剂、耗材和劳动(比ELISA法低10~100倍),降低检测成本,同时还提高了分析效率,仅需少量样本即可获得大量信息。目前同时检测10项细胞因子的液相芯片试剂的费用大约为$1300/96孔($130/项/96孔),这比检测单项指标的ELISA试剂的成本($500/项/96孔)低得多,而且还可随检测指标的增加而进一步降低费用。 
    【10】 灵活
    适用于各种蛋白质和核酸的分析。商品化试剂盒的使用者只需增减探针交联微球和标记分子即可满足不同检测项目的需要。 

    液相芯片技术的应用进展

    液相芯片是继平面芯片之后的一种新型芯片技术,是一种非常灵活的多元分析平台,在核酸、蛋白质等生物大分子的大规模分析中具有巨大的应用潜力,可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体配体识别分析等众多领域的研究,蛋白质蛋白质相互作用、蛋白质核酸相互作用分析等都可以在同一个平台上实现。鉴于液相芯片技术在高通量定性和定量检测上令人瞩目的优势,目前它在基因组学研究、蛋白质组学研究、药物开发、基础研究和临床诊断等方面的应用十分广泛,近几年来以此为平台的产品开发和应用十分活跃,研究者既可以根据研究需要自行制备探针交联微球,建立反应体系,也可使用种类繁多的商品化试剂盒进行分析。大体说来,液相芯片技术的应用包括两大部分:液相蛋白芯片和液相基因芯片,前者主要是基于抗原抗体反应,而后者实质为核酸杂交。现将液相芯片技术在检测细胞因子、病原微生物、基因突变以及HLA、基因表达分析、细胞信号转导途径研究等方面的应用综述如下:
    【1】定量检测细胞因子
    细胞因子参与多种免疫机能,某些细胞因子具有相同功能,并且调节其它细胞因子的合成和分泌,因此同时检测多种细胞因子有利于全面判断机体免疫功能、了解分子水平的免疫调节机制,在疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测方面有重要意义,还可用于研究发病机制、药物作用机理和药物临床试验。
    目前最常用于检测体液和细胞培养上清中细胞因子的方法有ELISATRFIA等,这些方法灵敏度、特异性和准确性都较好,但是也存在一些局限:每次仅能检测一种细胞因子,如果需要同时分析多种细胞因子,则检测费用较为昂贵并且费时,完成检测所需的样本量较大,非常浪费,对于一些量少的样本(如鼠血清、儿童患者标本)就比较困难。能够同时检测数种细胞因子的方法有RTPCR、Northern Blot等,但它们均不能准确定量分泌性细胞因子,而且每次检测的细胞因子数目有限。
    用传统方法检测多种细胞因子时,要求的样品量多,费用高,ELISA的检测范围仅1~2个数量级,而液相芯片可同时检测同一样品中的多种分子,而且具有特异、快速、灵活、重复性好的特点,其检测范围为3~4个数量级,检测灵敏度也远胜于ELISA,其优势是显而易见的。因此定量检测细胞因子成为目前液相芯片技术应用最为活跃和广泛的领域之一,尤其是2004年以来,随着市场上越来越多的商品化试剂盒的涌现,液相芯片技术检测细胞因子的文献报道数量迅猛增加,大有取代常规ELISA方法之势。
    de Jager[1]自行制备抗体交联微球,同时检测了人血浆和关节滑液中的30种细胞因子、趋化因子和粘附分子,其检测灵敏度为1.0~26.4 pg/ml,检测范围达4个对数值;检测添加上述分子正常人血浆的回收率为83%~119%,平均批内变异系数为8.1%,平均批间变异系数为11.4%;液相芯片与ELISA法检测结果的相关系数R2为0.88~0.99。
    国外多家公司已推出了商品化的细胞因子液相芯片检测试剂盒,比如R&D 公司的Flurokine MAP系列、Linco Research公司的LINCOplex 试剂盒、BioSource公司的Antibody Bead Kit、BioRad公司的BioPlex系列等,可用于来自人、小鼠、大鼠的样品,既有一次检测单种细胞因子的试剂盒,也有预先混合多种细胞因子抗体交联微球而一次检测多个指标者,研究者还可根据自身需要自行选购某几种交联微球。这些试剂盒在检测灵敏性、准确性、可靠性等方面都具有很好的性能,如BioRad公司的BioPlex细胞因子检测试剂盒,其灵敏度可达2~4 pg/ml,最高检测浓度可达16 000~32 000 pg/ml,线性检测范围为3~5个数量级,批内和批间变异系数小于10%。不过这些试剂盒均未获得FDA用于体外诊断的批准,仅限于实验研究用途。如Funding[2] 用BioRad公司的BioPlex试剂盒同时定量测定角膜移植排斥患者房水中的17种细胞因子,发现这些患者的细胞因子水平显著增高。Szodoray[3]用Biosource公司的试剂盒检测了9名原发性Sjogren综合征患者血浆中可能与细胞死亡有关的25种细胞因子水平,发现某些细胞因子水平在患者与健康人之间差异显著,作者认为能同时检测多种细胞因子的液相芯片技术可成功用于诊断Sjogren综合征及个性化抗细胞因子治疗。
    与传统ELISA方法相比,液相芯片除了能同时检测细胞培养上清、血清、血浆、全血、组织匀浆液、泪液、脑脊液甚至新生儿干血斑等标本中的多种细胞因子,一次检测即可确定Th1/Th2特异性免疫应答,能为了解免疫应答中的细胞因子分泌情况提供更为全面的信息外,还至少具有以下优点:①比ELISA灵敏度更高,标准曲线在更低的浓度仍能保持线性:这是因为液相芯片与ELISA依靠酶放大作用的间接检测相比,荧光读值更直接、稳定、灵敏;此外,液相芯片检测中洗涤更彻底,微球表面积小,减少了非特异性结合;而且交联抗体是共价结合于微球上,这不同于ELISA依靠疏水作用通过物理吸附与固相载体结合。②比ELISA更准确:液相芯片最后报告的荧光值为100个微球荧光检测结果的中值,相当于重复进行了100次检测。③更经济:一次可对10~20余种细胞因子进行定量分析,检测单种细胞因子的试剂用量显著降低,样本需要量少(最多仅需100 μl),而ELISA检测同样数目的细胞因子需要数毫升样本。据估算,同时检测8种人细胞因子的费用仅为ELISA的1/17,样品用量仅为后者的1/20,因此大大节省了人力、时间和费用。
    【2】检测SNP
    单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP) 是指在基因组水平上由于单个核苷酸改变所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知遗传多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500~1 000个碱基对中就有1个,估计其总数可达300万个甚至更多。随着人类基因组计划的完成,基因组多态性研究,尤其是SNP检测,已经成为一个重要的研究热点。
    利用液相芯片技术进行SNP分析的研究报道已有很多,在此平台上可应用多种不同的SNP基因型分析方法,如单碱基链延伸法(single base chain extension,SBCE)、等位基因特异性引物延伸法(allelespecific primer extension,ASPE)、寡核苷酸连接法、直接杂交法、竞争杂交法等。
    采用液相芯片技术进行SNP分析,96孔板上每孔可检测50种SNP,仪器分析96个孔的数据只需1小时,这样每台仪器每天(8h)可完成30 000个以上基因型的检测,每个SNP的平均检测费用据估算不到$0.20(不包含PCR费用),并且主要取决于SNP数目、联检项目数量、标本数量、人力和试剂费用等因素。因此,用液相芯片进行SNP分析比DNA测序或者基因芯片操作简便、快速、高效、准确、重复性好、通量高、费用低,而且单管反应即可检测多种SNP,在研究SNP与疾病(心血管疾病、肥胖、肿瘤等)发生、法医鉴定等方面具有显著的优势和广阔的应用前景。Nishihama[4] 为评价有或无冠心病常见危险因素(高血压、高血脂、糖尿病)者基因多态性与心肌梗塞之间的关联,采用液相芯片法(PCR与序列特异性寡核苷酸探针杂交)确定了3 483人(1 192名心肌梗塞患者、2 291名对照)137个候选基因的164种多态性的基因型,发现9种不同的多态性与心肌梗塞显著相关(P<0.005),冠心病常见危险因素不同者其心肌梗塞相关基因多态性也不同。
    目前也已推出用于SNP检测的液相芯片试剂盒,如Tm Bioscience公司有用于临床同时检测因子V Leiden突变(G1691A)、凝血酶原(G 20 210 A)、MTHFR C677T和MTHFR A1 298 C突变、检测导致囊性纤维化的CFTR基因突变的遗传性疾病检测试剂盒(囊性纤维化检测试剂盒是被FDA批准的首个人类疾病多重基因分型体外诊断试剂),很适合用于高通量临床基因分型。Marligen Biosciences公司的YSNP鉴定系统和线粒体DNA筛选系统可分别检测人Y染色体上的96种SNP和人线粒体DNA超变区的30种SNP。 
    【3】 检测病原体和诊断感染性疾病
    应用液相芯片技术不仅可用免疫学方法检测机体感染病原体(包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等)后产生的血清抗体,或直接检测病原体抗原,也可在基因水平上检测病原体的核酸,其用途十分广泛,如血清学诊断、病原体分型、疫苗效力评价、食品安全、环境监测、生物反恐等。这方面的研究报道很多,一般都将液相芯片和传统的金标准ELISA法进行检测结果比较。 
    [1] 血清学诊断 检测抗病原体特异性抗体时一般采用间接法,即将病原体抗原(蛋白或多糖)交联在微球上,与样品中的相应抗体结合后,加入藻红蛋白标记的抗人IgG或IgM.
    Lukacs[5] 制备了抗原交联微球,不需洗涤步骤即可同时检测新生儿干血斑标本中的乙肝表面抗原、HIV1 p24、gp41抗体和丙型肝炎病毒NS3、NS4、核心抗原的抗体。Martins[6]在微球上交联A组链球菌的9种不同抗原(包括2种非特异性细胞外抗原、3种特异性抗原和4种与急性风湿热有关的组织抗原),定量分析患者感染A组链球菌后血清中的抗体反应。该方法仅需5 μl血清,90 min即完成分析,对链球菌溶血素O(SLO)、DNaseB的测定结果与传统方法100%相符,而且特异、灵敏,可检测浓度1 ng/ml以下的抗体。Kuller[7]直接在微球上交联全病毒抗原,用液相芯片技术检测恒河猴血浆中的抗病毒IgG抗体,以筛选未感染猴D型逆转录病毒、猴T淋巴细胞趋向性病毒、猴疱疹病毒1型、猴免疫缺陷病毒SPF动物,并与ELISA比较检测灵敏性、特异性、交叉反应性和通量。结果表明,这两种方法的检测结果高度相关(相关系数 r 为0.98~0.99),液相芯片灵敏度更高,却又不影响其特异性(达100%),不产生交叉反应,而且由于该方法的假阳性率低,因而可减少需用Western确证的血清样品数量。在时间方面,用液相芯片同时检测样品中抗4种病毒抗体所需的时间与ELISA检测抗单种病毒抗体所需时间相等。因此液相芯片在灵敏度、稳定性、通量等检测性能方面较ELISA更胜一筹。此外还有用液相芯片技术检测鼠疫杆菌、炭疽杆菌、EB病毒、西尼罗河病毒、流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、弓形体、小隐孢子虫等病原体特异性抗体的报道。 
    [2] 病原体的检测和分型 人乳头瘤病毒(HPV)可导致宫颈癌,宫颈癌是妇女的第二大肿瘤,每年死亡人数近250 000人。HPV感染后患宫颈癌的危险性与病毒型别有关。Schmitt[8]采用液相芯片技术实现了在一个反应中同时对22种高危型和低危型生殖道HPV的基因分型,它是通过PCR以及与交联在微球上的型特异性探针杂交而完成。其批间变异系数<10%,最低检测限为100~800 pg PCR产物。该方法与反向线点杂交法对94个临床标本的检测结果相符,而灵敏度更高。Wallac[9]也通过类似方法同时高通量、快速检测45种生殖道HPV的基因型。由于液相芯片法对检测HPV混合感染非常有效,因此十分适合用于常规诊断、大规模流行病学调查、肿瘤筛查、监测治疗干预效果及疫苗试验中评价疫苗效果等。Borucki[10]在液相芯片技术中引入了DNA树形大分子(dendrimer)信号放大方法,只使用基因组DNA即对单核细胞增生性李斯特菌菌株进行了血清型鉴定,该方法不需PCR扩增,而且与多重PCR不同的是,它易于通过设计更多针对不同区域的探针序列而提高分型的分辨率。
    Straub[11]先采取自动化的免疫磁珠分离技术从样品中分离大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、志贺氏菌,然后通过标记引物进行多重PCR,最后用液相基因芯片同时检测上述三种细菌。结果表明其检测限为100个菌/种。
    用液相芯片技术进行病原体基因检测和分型鉴定可将核酸杂交分析的特异性、可靠性及液相芯片技术的快速、灵敏性结合起来,PCR 1 h后即可完成鉴定,能精确区分相差一个核苷酸的不同种属细菌,灵敏度达到101~103基因组拷贝或<1 pg DNA。 
    [3] 疫苗效力评价 在用于疫苗临床试验,尤其是评价多价疫苗接种后的免疫应答反应方面,液相芯片技术非常适合同时测定同一血清样本中的多种微生物或多种血清型的特异抗体,与传统的ELISA相比,在检测结果上相关性好,更加灵敏,最低检测浓度可比ELISA低100倍,动态检测范围更宽,不必检测多种稀释度的血清,从而可提高检测的准确性,更能大大减少操作和时间,节约样品用量和费用。Villa[12]用液相芯片法在一项随机、双盲、安慰剂对照的多中心Ⅱ期试验中测定特异抗体水平,评价预防性四价HPV疫苗(HPV 6、11、16、18)的效果。Komatsu[13]用液相芯片技术检测肿瘤患者经肿瘤肽疫苗免疫接种后的血清抗肽抗体水平,该方法可迅速、准确地测定这6种抗肽抗体,检测结果与ELISA大致相同,它不仅与ELISA同样灵敏,而且血清样品用量少,检测成本低,耗时短。以检测100种抗肽抗体计算,液相芯片仅需血清1.5 μl,而ELISA需要900 μl;此外,液相芯片成本大约为ELISA的1/10,而检测1000名患者血清所需时间仅为ELISA的1/240。还有许多其它相关研究,如同时定量检测破伤风、白喉类毒素、流感嗜血杆菌B型多糖血清抗体,4种脑膜炎球菌血清型的血清IgG,23种肺炎球菌荚膜多糖血清型特异性IgG抗体等。 
    【4】 HLA分型
    人类白细胞抗原(HLA)是目前所知人体最复杂的遗传多态系统,HLA不但与个体对某些疾病(如强直性脊柱炎)的易感性有关,其最重要的用途还在于器官移植之前的组织配型。传统的血清学和细胞学配型检测方法耗时较长,难以快速向临床医生报告结果,而液相芯片技术为其提供了一个更好的选择,既可以用血清学方法检测抗HLA抗体,也可用分子生物学方法直接检测等位基因。
    利用液相芯片技术进行HLA血清学分型的灵敏度高于ELISA,而且还具有ELISA所不能比拟的高通量、省时和高效率,如ELISA 3 h仅能检测10个标本,而液相芯片可做94个标本,非常适用于临床。
    目前市场上用于组织配型的商品化体外诊断试剂盒有One Lambda 公司的LABScreen、Orchid Diagnostics公司的LifeMatch ID ClassⅠ/Ⅱ试剂盒、Tepnel Lifecodes公司的Lifecodes ClassⅠ/Ⅱ ID等,其原理是在微球上交联各种纯化抗原,检测人血清中的HLA Ⅰ类和Ⅱ类抗体。有研究认为液相芯片法检测抗体的灵敏度优于ELISA、补体介导的微量细胞毒试验和流式细胞术。因此,利用液相芯片进行HLA抗体研究的方法在临床上得到了广泛应用,如Zhang[14]通过监测同种异体肾移植患者移植术后抗供体HLA抗体的产生,认为该抗体的产生与急性体液排斥反应及肾移植物早期功能障碍强烈相关。
    利用液相芯片进行HLA基因分型的报道也不少见。Itoh[15]利用在微球上交联的寡核苷酸探针做PCRSSOP进行了HLAA、B、C和DRB1位点的高通量DNA分型,对1018名日本志愿者的DNA分析结果表明,该方法与核苷酸测序法相比,其准确率>99.9%,96个标本从提取DNA到确定4个HLA位点的基因型仅需5 h,是一种高通量、简单、快速的HLA分型方法。在商品化试剂盒方面,One Lambda 公司的LABType SSO以及Tepnel Lifecodes公司的LifeMatch HLASSO 分型检测试剂盒即是将生物素标记的PCR靶片段与交联于微球上的序列特异性寡核苷酸探针进行杂交,可检测出HLAA、B、C、DP、DQB1、DRB1、DRB3、4、5位点上的等位基因。
    【5】分析基因表达
    Flagella[16]采用支链DNA(branched DNA)与液相芯片技术相结合的方法,直接从细胞裂解物、组织匀浆中定量检测10种基因的mRNA表达情况,并可区分同源性大于95%的基因。该方法无需RNA纯化或者靶基因扩增过程,而用支链DNA放大信号。其特异性高,交叉反应<0.2%,检测灵敏度为25 000个RNA转录本。
    小分子RNA(miRNA)是一组保守的单链短RNA,约22个核苷酸长度,它们具有重要的基因表达调控作用,是目前各国学者的研究热点。Lu[17]用液相芯片技术对来自334个标本(包括多种人类肿瘤)的217种哺乳动物miRNA进行了表达分析。观察到miRNA表达谱可反映出肿瘤的细胞来源及分化状态,肿瘤中的miRNA较之正常组织通常下调。作者将miRNA表达谱成功用于对分化不良的肿瘤进行分类,而mRNA表达谱用于同一标本时却非常不准确。这些发现说明miRNA表达谱具有用于肿瘤诊断的潜力。此外,分析肿瘤相对于正常组织miRNA表达谱的变化还可筛选出感兴趣的miRNA,以深入探讨其在肿瘤发生发展中的作用。孙凯[18] 应用液相芯片技术进行肝细胞癌(HCC)及毗邻癌旁组织中miRNA表达谱差异分析,并选取部分筛选出的差异表达miRNA,以半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和Western blot分析其相对应的靶mRNA和目的蛋白表达状况。作者认为液相芯片筛选差异表达miRNA可为研究HCC发病机制和诊断治疗提供新的思路。
    3.6 研究细胞信号转导途径
    Mu[19]为研究resistin是否对人内皮细胞有直接作用,将人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)用无血清培养基培养后,用resistin处理,然后取细胞裂解液用BioRad公司的“磷酸化蛋白和总靶蛋白检测试剂盒”分析MAPK磷酸化蛋白和总蛋白,以二者的比值评价MAPK的磷酸化状态。结果表明,人resistin可通过活化ERK 1/2、p38信号转导途径而诱导HCAEC增殖和迁移,提示人resistin可能在与血管发生有关的血管疾病中发挥作用。Sakai[20]为研究缺失突变的EGFR(表皮生长因子受体)的生物学作用,将转染EGFR的293细胞、人非小细胞肺癌细胞系A549、PC9细胞在加入EGF培养后,取细胞裂解液用上述磷酸化蛋白检测试剂盒定量分析EGFR、p44/42 MAPK、p38 MAPK、ATF2、JNK、IКBα、STAT3的磷酸化蛋白,以确定这些细胞经EGF刺激后的下游细胞信号转导机制。
    除了上述应用以外,液相芯片技术还可用于筛选过敏原、检测自身抗体、肿瘤标志物[21]及其他生物标志物分子、研究酶/底物、DNA蛋白相互作用、蛋白蛋白等分子相互作用、分析蛋白表达等方面。 

    液相芯片技术小结

     液相芯片技术以其高通量、准确、快速、灵敏、特异、多重检测、操作简便、可定性定量等显著优点成为一种极具吸引力的大规模生物检测平台,几乎可用于任何分子相互作用的检测。可以预见,随着高特异性、高亲和力抗体的产生以及微球、分析仪器和软件的不断发展改进,能同时检测的指标数目还将不断增加,灵敏度也将不断提高,并逐渐实现仪器微型化和操作自动化,该技术不仅将丰富生命科学研究的实验手段,大大推进基础研究进程,还将在临床诊断、高通量药物筛选、环境监测、农业检测、法医学等领域中掀起一场技术革命。

    芯片封装技术/芯片技术 编辑

     我们经常听说某某芯片采用什么什么的封装方式,在我们的电脑中,存在着各种各样不同处理芯片,那么,它们又是是采用何种封装形式呢?并且这些封装形式又有什么样的技术特点

    芯片封装生产车间芯片封装生产车间

    以及优越性呢?

    DIP双列直插式封装

    DIP(DualIn-line Package)是指采用双列直插形式封装的集成电路芯片,绝大多数中小规模集成电路(IC)均采用这种封装形式,其引脚数一般不超过100个。采用DIP封装的CPU芯片有两排引脚,需要插入到具有DIP结构的芯片插座上。当然,也可以直接插在有相同焊孔数和几何排列的电路板上进行焊接。DIP封装的芯片在从芯片插座上插拔时应特别小心,以免损坏引脚。
    DIP封装具有以下特点:
    【1】适合在PCB(印刷电路板)上穿孔焊接,操作方便。
    【2】芯片面积与封装面积之间的比值较大,故体积也较大。
    Intel系列CPU中8088就采用这种封装形式,缓存(Cache)和早期的内存芯片也是这种封装形式。

    QFP塑料方型扁平式封装和PFP塑料扁平组件式封装

    QFP(Plastic Quad Flat Package)封装的芯片引脚之间距离很小,管脚很细,一般大规模或超大型集成电路都采用这种封装形式,其引脚数一般在100个以上。用这种形式封装的芯片必须采用SMD(表面安装设备技术)将芯片与主板焊接起来。采用SMD安装的芯片不必在主板上打孔,一般在主板表面上有设计好的相应管脚的焊点。将芯片各脚对准相应的焊点,即可实现与主板的焊接。用这种方法焊上去的芯片,如果不用专用工具是很难拆卸下来的。
    PQFP(Plastic Flat Package)方式封装的芯片与QFP方式基本相同。唯一的区别是QFP一般为正方形,而PFP既可以是正方形,也可以是长方形。
    QFP/PFP封装具有以下特点:
    【1】适用于SMD表面安装技术在PCB电路板上安装布线。
    【2】适合高频使用。
    【3】操作方便,可靠性高。
    【4】芯片面积与封装面积之间的比值较小。
    Intel系列CPU中80286、80386和某些486主板采用这种封装形式。

    PGA插针网格阵列封装

    PGA(Pin Grid Array Package)芯片封装形式在芯片的内外有多个方阵形的插针,每个方阵形插针沿芯片的四周间隔一定距离排列。根据引脚数目的多少,可以围成2-5圈。安装时,将芯片插入专门的PGA插座。为使CPU能够更方便地安装和拆卸,从486芯片开始,出现一种名为ZIF的CPU插座,专门用来满足PGA封装的CPU在安装和拆卸上的要求。
    ZIF(Zero Insertion Force Socket)是指零插拔力的插座。把这种插座上的扳手轻轻抬起,CPU就可很容易、轻松地插入插座中。然后将扳手压回原处,利用插座本身的特殊结构生成的挤压力,将CPU的引脚与插座牢牢地接触,绝对不存在接触不良的问题。而拆卸CPU芯片只需将插座的扳手轻轻抬起,则压力解除,CPU芯片即可轻松取出。
    PGA封装具有以下特点:
    【1】插拔操作更方便,可靠性高。
    【2】可适应更高的频率。
    Intel系列CPU中,80486和Pentium、Pentium Pro均采用这种封装形式。

    BGA球栅阵列封装

    随着集成电路技术的发展,对集成电路的封装要求更加严格。这是因为封装技术关系到产品的功能性,当IC的频率超过100MHz时,传统封装方式可能会产生所谓的“CrossTalk”现象,而且当IC的管脚数大于208 Pin时,传统的封装方式有其困难度。因此,除使用QFP封装方式外,现今大多数的高脚数芯片(如图形芯片与芯片组等)皆转而使用BGA(Ball Grid Array Package)封装技术。BGA一出现便成为CPU、主板上南/北桥芯片等高密度、高性能、多引脚封装的最佳选择。
    BGA封装技术又可详分为五大类:
    【1】PBGA(Plasric BGA)基板:一般为2-4层有机材料构成的多层板。Intel系列CPU中,Pentium II、III、IV处理器均采用这种封装形式。
    【2】CBGA(CeramicBGA)基板:即陶瓷基板,芯片与基板间的电气连接通常采用倒装芯片(FlipChip,简称FC)的安装方式。Intel系列CPU中,Pentium I、II、Pentium Pro处理器均采用过这种封装形式。
    【3】FCBGA(FilpChipBGA)基板:硬质多层基板。
    【4】TBGA(TapeBGA)基板:基板为带状软质的1-2层PCB电路板。
    【5】CDPBGA(Carity Down PBGA)基板:指封装中央有方型低陷的芯片区(又称空腔区)。
    BGA封装具有以下特点:
    【1】I/O引脚数虽然增多,但引脚之间的距离远大于QFP封装方式,提高了成品率。
    【2】虽然BGA的功耗增加,但由于采用的是可控塌陷芯片法焊接,从而可以改善电热性能。
    【3】信号传输延迟小,适应频率大大提高。
    【4】组装可用共面焊接,可靠性大大提高。
    BGA封装方式经过十多年的发展已经进入实用化阶段。1987年,日本西铁城(Citizen)公司开始着手研制塑封球栅面阵列封装的芯片(即BGA)。而后,摩托罗拉、康柏等公司也随即加入到开发BGA的行列。1993年,摩托罗拉率先将BGA应用于移动电话。同年,康柏公司也在工作站、PC电脑上加以应用。直到五六年前,Intel公司在电脑CPU中(即奔腾II、奔腾III、奔腾IV等),以及芯片组(如i850)中开始使用BGA,这对BGA应用领域扩展发挥了推波助澜的作用。目前,BGA已成为极其热门的IC封装技术,其全球市场规模在2000年为12亿块,预计2005年市场需求将比2000年有70%以上幅度的增长。

    CSP芯片尺寸封装

    随着全球电子产品个性化、轻巧化的需求蔚为风潮,封装技术已进步到CSP(Chip Size Package)。它减小了芯片封装外形的尺寸,做到裸芯片尺寸有多大,封装尺寸就有多大。即封装后的IC尺寸边长不大于芯片的1.2倍,IC面积只比晶粒(Die)大不超过1.4倍。
    CSP封装又可分为四类:
    【1】Lead Frame Type(传统导线架形式),代表厂商有富士通、日立、Rohm、高士达(GOLDSTAR)等等。
    【2】Rigid Interposer Type(硬质内插板型),代表厂商有摩托罗拉、索尼、东芝、松下等等。
    【3】Flexible Interposer Type(软质内插板型),其中最有名的是tessera公司的microBGA,CTS的sim-BGA也采用相同的原理。其他代表厂商包括通用电气(GE)和NEC。
    【4】Wafer Level Package(晶圆尺寸封装):有别于传统的单一芯片封装方式,WLCSP是将整片晶圆切割为一颗颗的单一芯片,它号称是封装技术的未来主流,已投入研发的厂商包括FCT、Aptos、卡西欧、EPIC、富士通、三菱电子等。

    CSP封装具有以下特点:
    【1】满足了芯片I/O引脚不断增加的需要。
    【2】芯片面积与封装面积之间的比值很小。
    【3】极大地缩短延迟时间。
    CSP封装适用于脚数少的IC,如内存条和便携电子产品。未来则将大量应用在信息家电(IA)、数字电视(DTV)、电子书(E-Book)、无线网络WLAN/GigabitEthemet、ADSL/手机芯片、蓝芽(Bluetooth)等新兴产品中。

    MCM多芯片模块

     为解决单一芯片集成度低和功能不够完善的问题,把多个高集成度、高性能、高可靠性的芯片,在高密度多层互联基板上用SMD技术组成多种多样的电子模块系统,从而出现MCM(Multi Chip Model)多芯片模块系统。
    MCM具有以下特点:
    【1】封装延迟时间缩小,易于实现模块高速化。
    【2】缩小整机/模块的封装尺寸和重量。
    【3】系统可靠性大大提高。

    TSOP(Thin Small Outline Package)薄型小尺寸封装

    TSOP内存封装技术的一个典型特征就是在封装芯片的周围做出引脚,如SDRAM内存的集成电路两侧都有引脚,SGRAM内存的集成电路四面都有引脚。TSOP适合用SMT技术(表面安装技术)在PCB(印制电路板)上安装布线。TSOP封装外形尺寸时,寄生参数(电流大幅度变化时,引起输出电压扰动) 减小,适合高频应用,操作比较方便,可靠性也比较高。改进的TSOP技术目前广泛应用于SDRAM内存的制造上,不少知名内存制造商如三星、现代、Kingston等目前都在采用这项技术进行内存封装。不过,TSOP封装方式中,内存芯片是通过芯片引脚焊接在PCB板上的,焊点和PCB板的接触面积较小,使得芯片向PCB办传热就相对困难。而且TSOP封装方式的内存在超过150MHz后,会产品较大的信号干扰和电磁干扰。 
    总之,由于CPU和其他超大型集成电路在不断发展,集成电路的封装形式也不断作出相应的调整变化,而封装形式的进步又将反过来促进芯片技术向前发展。

    国内生物芯片技术研发意义深远/芯片技术 编辑

     为了更好了解国内外生物芯片最新研究应用动态和发展方向,促进生物技术和生命科学相关行业的经验交流和沟通,提高国内生物芯片成果应用转化率,科技部、清华大学、中国医药生物技术协会、中国医药生物技术协会生物芯片分会及生物芯片北京国家工程研究中心(暨博奥生物有限公司)在北京召开了生物芯片在医学和食品安检中的应用大会。在大会中出现一个新的亮点,出席会议的宁波大学校方领导冯志敏校长助理和生命科学与生物工程学院李太武院长,同生物芯片北京国家工程研究中心主任程京教授,就在浙江宁波建立生物芯片北京国家工程研究中心海洋生物分中心事宜进行了洽谈,并于4月29日签定了合作协议。

    生物芯片是本世纪八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术,它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固格体芯片表面构建的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。常用的生物芯片分为三大类:即基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列,能够在短时间内分析大量的生物分子,使人们快速准确地获取样品中的生物信息,效率是传统检测手段的成百上千倍。它将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。

    对于生物芯片的高新技术,全球各国政府、科技界和产业界均对其高度重视,投入了大量人力、物力和财力,对其进行研发和产业化。中国从1997年以后也开始加大了生物芯片领域的投入,尤其是从2000年开始,在时任国务院主要领导朱镕基等同志的亲自关怀和批示下,中国的生物芯片技术和产业化取得更为迅速地跨越式发展。由国家发展和改革委员会上报国务院批准,以清华大学为主要发起人,联合华中科技大学、中国医学科学院和军事医学科学院等三家科研单位共同参与,集中全国的优势技术资源、人力资源和资金资源成立了生物芯片北京国家工程研究中心(暨博奥生物有限公司)。生物芯片北京国家中心(博奥生物)现已发展成为我国生物芯片领域规模最大、实力最强、技术最先进的国家级研究开发和产业化基地。目前,博奥生物总资产达5.41亿元,拥有24,000平方米的研发、生产和运营设施,自2003年开始将产品推向市场后,销售一直保持着每年100%~300%的增长势头。其中多项产品填补了国内空白,部分产品国际领先,并远销欧美12个国家,获得广泛好评。

    从生物芯片国家中心筹建伊始至今,许多国家领导人对中心的发展非常关心,或亲临现场考察、或先后听取汇报、或做出重要批示。全国人大常委会原副委员长、中国科学技术协会荣誉主席周光召院士,卫生部部长陈竺院士,教育部部长周济,科技部副部长李学勇、程津培、马颂德,国家质量监督检验检疫总局副局长魏传忠,云南省省委书记白恩培、时任省长徐荣凯,江西省省委书记孟建柱,清华大学校长顾秉林院士,南开大学校长饶子和院士等领导都曾多次亲临生物芯片国家中心考察和指导工作。

    进入21世纪,面对人口激增、资源短缺、环境恶化三大人类共同的难题,国际上普遍认为海洋是解决上述问题的战略要地,人类最紧缺的战略物质都可以从海洋中获得。海洋生物技术因此成为面向21世纪的一场竞赛,世界各国纷纷制订“海洋生物技术计划”,海水养殖、海洋药物、功能新基因、环境保护等成为国际竞争的热点。
    针对浙江沿海重要的经济水产动植物,进行应用基础研究,对种质资源进行合理的建库,建立与优良性状相关的种质品系与遗传生化标记;开发与引进新的适于浙江海区养殖的具有重要经济发展潜力的新品种;摸清浙江沿海主要活性资源的种类与资源特点,建立相关的海洋药物可持续发展的药源生物资源库与活性数据库,对海洋生物资源的合理开发与利用具有重要的指导意义。海洋生物分钟芯拟重点针对海水养殖动物及其病原的功能基因组学,以生物芯片为主要技术手段,筛选和鉴定与重要海水养殖动物生长调控、免疫与抗病等紧密相关的功能基因,开发出新型高效安全的海水养殖动物促生长剂、优质饲料添加剂或免疫增强剂产生一批面向国家重大需求、具有显著资源特色和作用机制独特、具有自主知识产权和国际市场开发前景的海洋基因工程产物、候选产物功能基因等,使我国海洋生物功能基因及其产物研究开发的综合能力接近或达到发达国家先进水平,提升研发水平和创新能力,提高相关产品的市场竞争力,创造更高的经济和社会效益。

    据悉,生物芯片北京国家工程研究中心海洋生物分中心的组建,意味着生物芯片北京国家工程研究中心和宁波大学将在海洋生物领域就生物芯片的基础研究、产品开发及产业化进行战略合作。

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    扩展阅读
    1基因芯片技术
    2生物谷生物频道 组织芯片技术
    3中国科学院力学所 蛋白质芯片技术
    4我国自主开发专利产品蛋白芯片技术
    5浅析液相芯片技术的原理与应用进展

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