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  • 逆转录酶”是“反转录酶”的同义词。

    反转录酶

    反转录酶(Reversetranscripatase)是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。

    编辑摘要

    目录

    简介/反转录酶 编辑

    反转录酶反转录酶

    这是一种莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukeminvirus)反转录酶(简称M-MLVRTase),

    这个酶已经作了遗传性上的改变,即除去了与它联在一起的核糖核酸酶H活性(一种专门切割DNA与RNA杂交链上RNA分子的酶)。这个酶应用于cDNA的第一链合成和引物的延伸。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子,当以mRNA为模板时,先合成单链DNA(ssDNA),再在反转录酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下,以单链DNA为模板合成“发夹”型的双链DNA(dsDNA),再由核酸酶S1切成二条单链的双链DNA。因此,反转录酶可用来把任何基因的mRNA反转录成cDNA拷贝,然后可大量扩增插入载体后的cDNA。也可用来标记cDNA作为放射性的分子探针。

    逆转录酶(M-MLV)从MoloneyMurineLeukemiaVirus分离出来,可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。本酶是通过点突变使RNaseH活性缺失,所以它具有的DNA聚合酶的活性与野生型相同,同时其延伸能力也有显着提高。逆转录酶(M-MLV)一个活性单位定义为在37℃,10min条件下,使1nmol的脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量。

    合成步骤/反转录酶 编辑

    反转录酶反转录酶

    1、使用前每个组份轻轻混匀,然后2000rpm离心20s;

    2、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管,依次加入2~5μgRNAnμL

    3、65℃保温5min,然后冰浴5min;

    4、往3步骤中的0.2ml离心管依次加入下列组份

    RNase抑制剂(40u/μL)0.5μL

    10×M-MLVReactionBuffer2μL

    DTT(200mM)1μL

    逆转录酶(M-MLV)1μL

    5、轻轻混匀后,然后2000rpm离心20s;

    6、先在37℃保温1hr,然后70℃保温15min;

    7、上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。

    主要特点/反转录酶 编辑

    多反转录酶都具有多种酶活性,主要包括以下几种活性

    ①DNA聚合酶活性;以RNA为模板,催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物,多为色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此没有校正功能,所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高

    ②RNase H活性;由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子,将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子

    ③DNA指导的DNA聚合酶活性;以反转录合成的第一条DNA单链为模板,以dNTP为底物,再合成第二条DNA分子

    除此之外,有些反转录酶还有DNA内切酶活性,这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用,目它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板,在反转录酶的作用下,合成出互补的DNA(cDNA),由此可构建出cDNA文库(cDNa library),从中筛选特异的目的基因,这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法,详见基因工程一章

    质量控制/反转录酶 编辑

    反转录酶反转录酶

    1.切口酶:在与200单位酶37oC保温60分钟后,超螺旋质粒保留在90%以上。 2.DNase测定:200单位酶与50ng3H-DNA37oC保温60分钟,分解出的放射性低

    于1%。

    3.RNase测定:200单位酶与50ng3H-RNA37oC保温60分钟,分解出的放射性低

    于3%。

    4.第一链cDNA的反应:在标准化的反应中,200单位酶催化从1mg1.2kbRNA或

    1mg7.5kbRNA将同位素掺入到cDNA中,通过放射自显影,对于1.2kb的RNA,产物

    cDNA是单一的、全长的条带。对于7.5kb的RNA产物有部分是全长的条带。用这二种

    RNA放射性转换到cDNA中有12%。

    5.RNaseH活性:200单位酶与polyA:polydT37oC保温60分钟,释放出的放射

    性要低于1%。

    6.物理纯度:在SDS-PAGE上>90%纯。

    储存缓冲液:20mMTris-HClpH7.5;200mMNaCl;0.1mMEDTA;1mMDTT;0.01%NP-40(一种

    去垢剂)和50%甘油。

    反应缓冲液:250mMTris-HClpH8.3;375mMKCl;15mMMgCl2;50mMDTT(以Part#M531A供应)。

    使用说明/反转录酶 编辑

    反转录酶反转录酶

    M-MLV反转录酶比AMV反转录酶缺乏连续性,因此要获得像AMV反转录酶反应中产生同样量的cDNA就要求使用较多单位的M-MLV反转录酶。用1微克的mRNA起始合成第一条链的cDNA,要用8单位的M-MLV反转录酶才相当于1单位的AMV反转录酶的作用。

    该酶很容易被亚精胺(Spermidine)所抑制,该酶绝对不能用Promega的RiboprobeAMV反转录酶5X反应缓冲液,也不能用Promega的RiboclonecDNA第一条链缓冲液,因为这二种缓冲液均含有亚精胺。

    注意事项/反转录酶 编辑

    反转录酶反转录酶

    在进行RT反应之前,应考虑以下几个方面:

    1、RNA

    成功的cDNA合成来自高质量的RNA,高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA或SDS。在提取RNA的过程中,要特别防止RNase的污染,同时在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链cDNA合成反应中,在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNaseA,B,C对RNA的降解,并不能防止皮肤上的RNase,因此尽管使用了这些抑制剂,也要小心不要从手指上引入RNase,实验过程中经常更换新手套。

    2、引物的选择

    OligodT

    选择OligodT时,要求RNA必须有PolyA,所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT,所以对RNA样品的质量要求较高,最好不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应,建议推荐使用OligodT引物。使用OligodT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。

    随机引物

    适合各种RNA的RT,尤其适合模板丰度很低的情况(比如某个gene表达量很低)。选择随机引物时,第一链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板,然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系,一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng,如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng,可能会导致小片段产物(<500bp)的增加和长片断、全长产物产物的降低。

    特异性引物

    特异性引物只能用你设计引物时的下游引物做RT,引物设计质量影响RT的结果,而且不同引物退火温度本来就不相同,所以按照说明书按照一个温度做不是最佳选择,一般不推荐。

    医学发展/反转录酶 编辑

    细胞的衰老和老化被认为和染色体末端由重复的DNA(TTAGGG)序列所组成的端粒序列的丢失相关。随着细胞的每次分裂,端粒会丢失50~200bp,当端粒缩短到一定程度就不再保护染色体免受重组或降解,细胞分裂的控制点就此得到信号而产生作用,可使细胞分裂停止并进入老化过程致细胞死亡。端粒长度的维持即重复序列向染色体末端的添加由端粒酶所催化。端粒酶组成包括RNA组分、端粒酶相关蛋白和端粒酶反转录酶。其中端粒酶反转录酶对端粒酶活性起关键作用。在人体,端粒酶活性存在于干细胞、生殖细胞、部分有再生能力的体细胞及绝大多数恶性肿瘤组织中。它的高活性是肿瘤细胞恶性增殖的一项重要条件,但其适量表达又具有延长细胞寿命的作用。随着干细胞分化的进行,端粒酶活性也随之降低,至终末分化细胞已无法测到端粒酶。适度上调和维持干细胞的端粒酶活性,对提高干细胞体外复制和扩增能力及揭示干细胞衰老机制都将具有重要意义。近期研究发现,在富含表皮干细胞的表皮基底层和生长期毛囊中均有端粒酶活性表达,但目前对不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶表达特征仍缺乏相应的了解。弄清楚它们在表皮干细胞中的表达变化及其规律,将会增加对表皮干细胞的认识,获得更多有关表皮干细胞复制调控的新信息。

    成功将人表皮干细胞体外分离培养的基础上,对比观察不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的差异特征,结果表明人胚胎、少儿、成人皮肤来源的表皮干细胞均有端粒酶反转录酶表达,其表达强度依次减弱。提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持表皮干细胞在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义。

    相关文献

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