于和伟从小喜欢文艺,但因家庭困难去学了幼师。幼师毕业后,他偷偷考入了抚顺话剧团,成为一名话剧演员,后来被上海戏剧学院录取。1999年,他参演了首部电视剧《曹操》而正式进入演艺圈,但之后更多在电视剧中跑龙套,直到2002年《大宅门2》中饰演白景琦的孙子白占安,才得到一个戏份较多的角色。[7]同年,他还出演了首 部电影《铁血柔情》。[8]之后,他出演了众多作品,虽没有引起关注,但磨练了演技。[7]2009年,他凭借主演的电视剧《纸醉金迷》提名第十五届上海电视节白玉兰奖最佳男演员奖,演技获得认可。[9][10] 2010年,于和伟主演了新版《三国》,在剧中饰演刘备。该剧播出期间平均收视率保持在1.3%,并连续48天保持四个台总收视率超过4%,成为当年古装剧收视之冠,于和伟也因“刘皇叔”一角在39岁终于走红。[11][12][13]之后,他的戏约不断增多,主演了《幸福在路上》《青盲》《刑警队长》等众多作品,并在2014年凭借《下一站婚姻》获得了华鼎奖当代题材最佳男演员奖。[14]2016年,他出演冯小刚执导的电影《我不是潘金莲》,并获得金鸡奖最佳男配角奖。[15][16]次年,他在古装历史剧《大军师司马懿之军师联盟》中饰演曹操,并凭此获得白玉兰奖最佳男配角奖和飞天奖优秀男演员奖。[17][18][19]