蔗糖密度梯度离心

蔗糖密度梯度离心
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用蔗糖密度梯度离心法进行了禽脑脊髓炎病毒的纯化，为了研究高等植物细胞质膜上的质子泵ATP酶的作用机理，需要纯化细胞质膜，Hodges等首先使用蔗糖梯度法纯化燕麦根细胞质膜，现在广泛地应用着，Lundborg等应用水溶性多聚体(PEG/Dextran)两相分配法纯化小麦根细胞质膜后，两相分配法在质膜纯化上逐步引人注意，被认为是一种优于蔗糖梯度法的方法，Lundborg等用两相分配法分。

应用方法

离心方法

蔗糖密度梯度离心，将禽脑脊髓炎病毒（AEV）L2Z株、Van Roekel株和1143株分别经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，接毒后，以4500r/min离心及胰腺，用玻璃匀浆器制成10%的组织悬液。组织悬液经3次反复冻融后，以4500r/min离心15min，取上清液。而后用氯仿处理，取水相，经冷冻真空浓缩，进行不连续蔗糖密度梯度离心。取出含AEV的组分，用PBS稀后超速离心除去蔗糖。亦称平衡密度梯度离心法。用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。
利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取得许多成果。为得到必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯[sè]浓度梯度离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。通常利用分析超离心机，但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况，利用密度差，使用分离超离心机，采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。〔2〕采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。